Influence of tumor microenvironment and cancer cells interplay on cutaneous squamous cell carcinoma progression and immunotherapy response

Abstract

[eng] Squamous cell carcinoma of the skin (cSCC) is the second most common type of nonmelanoma skin cancer. Treatment with immunotherapy based on immune checkpoint inhibitors (ICI) was recently approved by the FDA and EMA for this type of tumour. However, a significant percentage of patients do not benefit from this treatment, showing primary or acquired resistance. Dr. Muñoz's group studies the molecular and cellular mechanisms that cause the progression of cSCCs from a well-differentiated profile (tumor cells with epithelial characteristics) to a poorly differentiated profile (tumor cells with mesenchymal characteristics). Previous data from the group in a mouse model of cSCC progression showed that the presence of plastic cells (hybrid tumor cells with intermediate features between epithelial and mesenchymal) caused the progression of these tumors to a poorly differentiated profile. In addition, these poorly differentiated and mesenchymal tumors are strongly infiltrated by immunosuppressive cells (M2 macrophages, MDSCs and regulatory T cells) which caused a state of exhaustion (dysfunctional state) in cytotoxic T cells, causing resistance to ICI treatments in these tumor types. In the present thesis we propose to study the intercommunication between tumor cells and immunological cells present in the tumor microenvironment (TME), which are responsible for promoting the progression of cSCC tumors and the recruitment of immunosuppressive cells. To study the cytokines released by M2 macrophages and MDSCs that could cause the acquisition of the mesenchymal profile by tumor cells, primary cultures of BMDM (bone marrow-derived macrophages) and MDSCs were established from the spleen of mice carrying WD-SCCs and PD-SCCs. We observed that the factors derived from the M-MDSCs subpopulation isolated from mice carrying poorly differentiated tumors had a greater capacity to induce the loss of epithelial characteristics of tumor cells. Subsequently, we identified the cytokines differentially secreted by this subpopulation and obtained a list of five candidate cytokines (BAFF, IL-28, CCL20, CCL21 and IL-7) that could be responsible for the acquisition of mesenchymal characteristics, as has been seen in other tumor types. Future experiments should clarify whether the signaling of these cytokines promotes the acquisition of a mesenchymal profile and are responsible for the progression of cSCCs. We also studied the factors secreted by mesenchymal tumor cells from poorly differentiated tumors that could be responsible for recruiting immunosuppressive cells and establishing a hostile TME for the antitumor function of cytotoxic T cells. First, we identified the cytokines secreted by these mesenchymal tumor cells: CXCL1, CSF3 and CCL2. Subsequently, we blocked its signaling in vivo and characterized the TME profile of the treated tumors. We observed that the separate blockade of the 3 cytokines increased the presence of GranzymaB+ cells, which are cytotoxic T cells and active NK. However, this was not enough to slow tumor growth or increase tumor necrosis. Thus, we hypothesize that blocking the signaling of these cytokines alone is not sufficient to obtain strong antitumor effects, but their combination with ICI could give synergistic antitumor effects. Next, we study alternative strategies to promote the antitumor response of ICI therapies in advanced cSCCs. Thus, we validated previous data from the group that demonstrated that mesenchymal tumor cells do not express the MHC-I protein, which participates in the presentation of antigens to cytotoxic T cells and is essential for these cells to identify and eliminate tumor cells. We observed that mesenchymal tumor cells had reduced transcriptional expression of Mhc-I compared to epithelial tumor cells. In addition, these mesenchymal tumor cells responded correctly to IFN-γ and exhibited increased Mhc-I expression. However, this transcriptional increase was not reflected in an increase in the MHC-I protein in the membrane. We were able to verify that the MHC-I protein was accumulating in perinuclear vesicles and was not being translocated to the cell membrane. In addition, this process was independent of the autophagic pathway unlike what has been described in other tumor types. Thus, we concluded that there was a post-translational dysregulation of MHC-I that prevented this molecule from translocating to the cell surface of mesenchymal tumor cells, making them invisible to the action of cytotoxic T cells. Finally, in an initial study in a small cohort of patients with sensitive cSCC and squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) refractory to ICI treatment, we obtained indications that ICI-resistant patients may have a higher content of hybrid and mesenchymal tumor cells and that these tumors would have a higher infiltrate of exhausted CD8 cells. However, these studies were carried out with a very limited number of patient samples. The observations obtained were valid in a larger cohort of cSCC patients, while a larger number of HNSCC patients would need to be analyzed to validate the results obtained.

[spa] El carcinoma escamoso de piel (cSCC) es el segundo tipo de cáncer de piel no melanoma más común. El tratamiento con inmunoterapia basada en immune checkpoint inhibitors (ICI) fue aprobado recientemente por la FDA y la EMA para este tipo de tumores. No obstante, un importante porcentaje de pacientes no se benefician de este tratamiento, mostrando resistencia primaria o adquirida. El grupo de la Dra. Muñoz estudia los mecanismos moleculares y celulares que causan la progresión de los cSCCs desde un perfil bien diferenciado (células tumorales con características epiteliales) hasta un perfil pobremente diferenciado (células tumorales con características mesenquimales). Datos previos del grupo en un modelo de progresión de cSCC en ratón demostraron que la presencia de células plásticas (células tumorales híbridas con características intermedias entre epiteliales y mesenquimales) causaban la progresión de estos tumores a un perfil pobremente diferenciado. Además, estos tumores pobremente diferenciados y mesenquimales están fuertemente infiltrados por células inmunosupresoras (macrófagos M2, MDSCs y células T reguladoras) lo que causaba un estado de exhaustion (estado disfuncional) en las células T citotóxicas, provocando resistencia a los tratamientos ICI en estos tipos tumorales. En la presente tesis se plantea estudiar la intercomunicación entre células tumorales y células inmunológicas presentes en el microambiente tumoral (TME), que son responsables de promover la progresión de los tumores cSCC y el reclutamiento de células inmunosupresoras. Para estudiar las citocinas liberadas por parte de los macrófagos M2 y las MDSCs que podrían provocar la adquisición del perfil mesenquimal por parte de las células tumorales, se establecieron cultivos primarios de BMDM (macrófagos derivados de la medula ósea) y MDSCs del bazo de ratones portadores de WD-SCCs y PD-SCCs. Observamos que los factores derivados de la subpoblación M-MDSCs aislada de ratones portadores de tumores pobremente diferenciados presentaban una mayor capacidad de inducir la perdida de características epiteliales de células tumorales. Posteriormente, identificamos las citoquinas diferencialmente secretadas por esta subpoblación y obtuvimos una lista de cinco citoquinas candidatas (BAFF, IL-28, CCL20, CCL21 y IL-7) que podrían ser responsables de la adquisición de características mesenquimales, como se ha visto en otros tipos tumorales. Futuros experimentos deberán esclarecer si la señalización de estas citoquinas promueve adquisición de un perfil mesenquimal y son responsables de la progresión de los cSCCs. También estudiamos los factores secretados por las células tumorales mesenquimales de los tumores pobremente diferenciados que pudieran ser responsables de reclutar células inmunosupresoras y establecer un TME hostil para la función antitumoral de las células T citotóxicas. Primeramente, identificamos las citoquinas secretadas por estas células tumorales mesenquimales: CXCL1, CSF3 y CCL2. Posteriormente, bloqueamos su señalización in vivo y caracterizamos el perfil del TME de los tumores tratados. Observamos que el bloqueo por separado de las 3 citoquinas aumentaba la presencia de células GranzimaB+, las cuales son células T citotóxicas y NK activas. No obstante, esto no fue suficiente para retrasar el crecimiento tumoral o aumentar la necrosis tumoral. Así, hipotetizamos que el bloqueo solo de la señalización de estas citoquinas no es suficiente para obtener efectos antitumorales contundentes, pero su combinación con ICI podría dar efectos antitumorales sinérgicos. Seguidamente, estudiamos estrategias alternativas para promover la respuesta antitumoral de las terapias ICI en cSCCs avanzados. Así, validamos datos previos del grupo que demostraban que las células tumorales mesenquimales no expresan la proteína MHC-I, la cual participa en la presentación de antígenos a las células T citotóxicas y es fundamental para que estas células puedan identificar y eliminar las células tumorales. Observamos que las células tumorales mesenquimales presentaban una expresión transcripcional reducida de Mhc-I en comparación de las células tumorales epiteliales. Además, estas células tumorales mesenquimales respondieron correctamente a IFN-γ y presentaron un aumento de la expresión de Mhc-I. No obstante, este aumento transcripcional no se reflejó en un aumento de la proteína MHC-I en membrana. Pudimos constatar que la proteína MHC-I se estaba acumulando en vesículas perinucleares y no estaba siendo translocada a la membrana celular. Además, este proceso era independiente de la vía autofágica a diferencia de lo que se ha descrito en otros tipos tumorales. Así, concluimos que había una desregulación post-traduccional de MHC-I que impedía que esta molécula translocara a la superficie celular de las células tumorales mesenquimales, haciéndolas invisibles a la acción de las células T citotóxicas. Finalmente, en un estudio inicial en una pequeña cohorte de pacientes con cSCC y con carcinoma escamoso de cabeza y cuello (HNSCC) sensibles y resistentes al tratamiento con ICI obtuvimos indicios que los pacientes resistentes a ICI podrían presentar un mayor contenido de células tumorales híbridas y mesenquimales y que estos tumores presentarían un mayor infiltrado de células CD8 exhausted. No obstante, estos estudios se hicieron con un número de muestras de paciente muy limitados. Las observaciones obtenidas fueron validas en una cohorte de pacientes cSCC mayor mientras que faltaría analizar un mayor número de pacientes HNSCC para validar los resultados obtenidos.