Novel pharmacological strategies for neurological conditions involving glutamate and adenosine

Abstract

[eng] Neuropsychiatric disorders such as schizophrenia and bipolar disorder present alterations in dopaminergic and glutamatergic neurotransmission, which has led to the development of therapeutic strategies targeting these systems. Recently, the adenosynergic system has emerged as a key regulator of dopaminergic and glutamatergic activity, with evidence that activation of adenosine receptorA2A can modulate dopaminergic transmission and affect neuropsychiatric symptoms. In addition, the interaction between the A2A receptor and the metabotropic glutamate receptor type 5 in the striatum represents a potential therapeutic convergence point for the treatment of these disorders. In this context, nanobodies have emerged as innovative tools for modulating membrane macromolecular interactions in a highly specific manner. Unlike conventional antibodies, nanobodies are heavy-chain antibody fragments that have advantages such as their small size, high stability, and ability to access inaccessible regions of proteins. In this thesis, we explore the development and characterization of the Nb43 nanobody, designed to modulate the glutamate receptor mGlu5R, as well as its Nb43-CGS21680 conjugate, which incorporates an A2AR agonist to enhance its effect. The thesis is divided into three chapters. In the first chapter, we characterize in vitro the binding and functional effect of Nb43 and Nb43-CGS21680 in cellular systems expressing mGlu5R and A2AR. In the second chapter, we evaluate the distribution, penetration into the central nervous system and pharmacological activity of these nanobodies in murine models. Finally, in the third chapter, we performed a meta-analysis of adenosine metabolism modulators in schizophrenia and bipolar disorder, to evaluate their clinical impact and therapeutic potential. The results of the in vitro study of Nb43 showed that Nb43 selectively binds to mGlu5R in a physiological context. On the other hand, Nb43-CGS21680 showed a dual-action profile, with simultaneous modulation of mGlu5R and A2AR. Interestingly, the co-activation of these receptors resulted in a more specific modulation of intracellular activity. In vitro experiments of PLA and NanoBiT confirmed the existence of functional interactions between mGlu5R and A2AR, supporting the hypothesis that these receptors form heteromers in the neuronal membrane. To evaluate the biodistribution of Nb43 and Nb43-CGS21680, we performed in vivo imaging studies after intravenous and intranasal administration. The results indicated that Nb43 does not cross the blood-brain barrier significantly when administered intravenously. However, in intranasal administration, small concentrations were detected in the olfactory bulb, suggesting a possible route of access to the central nervous system. The behavioral effects of Nb43 and Nb43-CGS21680 were evaluated after their intracerebroventricular administration, which allowed analyzing their direct impact on the central nervous system without the limitation of the blood-brain barrier. In the locomotion test, locomotor activity CGS21680 significantly reduced, in line with previous studies suggesting its anti-dopaminergic effect. Similarly, Nb43 and Nb43-CGS21680 also decreased locomotion, although with less intensity. This effect suggests that Nb43 could be modulating dopaminergic neurotransmission through its action on mGlu5R in the striatum. In the haloperidol-induced catalepsy test, catalepsy CGS21680 significantly increased, confirming its role in dopaminergic inhibition. Interestingly, Nb43 also exacerbated catalepsy, indicating that its effect on mGlu5R could be modulating the activity of the dopaminergic pathway. Unlike CGS21680, whose effects disappeared after 24-48 hours, Nb43-CGS21680 prolonged the catalepsy effect until 48 hours after administration, suggesting a more sustained mechanism of modulation of neurotransmission. Additionally, we performed catalepsy experiments after intranasal administration of Nb43 and Nb43-CGS21680. The results showed that Nb43 had a significant impact on haloperidol-induced catalepsy, while Nb43-CGS21680 showed no effects. This suggests that Nb43 was able to reach the central nervous system through the olfactory bulb, where mGlu5R is expressed and its role in modulating locomotion and balance has been reported. On the other hand, the meta-analysis study included clinical studies that evaluated the impact of adenosine metabolism modulators, such as allopurinol, dipyridamole, pentoxifylline, and propentophylline, on the symptomatology of schizophrenia and bipolar disorder. The results indicated that allopurinol, a xanthine oxidase inhibitor that raises adenosine levels, was the most studied and showed positive effects in reducing positive and negative symptoms of schizophrenia and bipolar disorder. Dipyridamole, an adenosine reuptake inhibitor, also showed improvements in positive symptoms, although studies were limited. Propentophylline, a xanthine derivative with neuroprotective and anti-inflammatory, had more marked effects on negative symptoms and cognitive impairment. The findings of the meta-analysis reinforce the adenosynergistic hypothesis of schizophrenia and bipolar disorder, which proposes that modulation of the adenosynergistic system may influence dopaminergic and glutamatergic neurotransmission. In this sense, the results suggest that strategies aimed at enhancing adenosynergistic signaling could represent a promising therapeutic avenue. Overall, this thesis contributes to the knowledge about the role of nanobodies in the pharmacology of membrane receptors and highlights the importance of the adenosynergic system in the modulation of dopaminergic and glutamatergic neurotransmission in neuropsychiatric disorders.

[cat] Els trastorns neuropsiquiàtrics com l’esquizofrènia i el trastorn bipolar presenten alteracions en la neurotransmissió dopaminèrgica i glutamatèrgica, cosa que ha portat al desenvolupament d’estratègies terapèutiques dirigides a aquests sistemes. Recentment, el sistema adenosinèrgic ha emergit com un regulador clau de l’activitat dopaminèrgica i glutamatèrgica, amb evidència que l’activació del receptor A2A d’adenosina pot modular la transmissió dopaminèrgica i afectar els símptomes neuropsiquiàtrics. A més, la interacció entre el receptor A2A i el receptor metabotròpic de glutamat tipus 5 a l’estriat representa un punt de convergència terapèutica potencial per al tractament d’aquests trastorns. En aquest context, els nanocossos han sorgit com a eines innovadores per modular interaccions macromoleculars de membrana de manera altament específica. A diferència dels anticossos convencionals, els nanocossos són fragments d’anticossos de cadena pesada que presenten avantatges com la seva petita mida, alta estabilitat i capacitat d’accedir a regions inaccessibles de les proteïnes. En aquesta tesi, explorem el desenvolupament i la caracterització del nanocòs Nb43, dissenyat per modular el receptor de glutamat mGlu5R, així com el seu conjugat Nb43-CGS21680, que incorpora un agonista d’A2AR per potenciar-ne l’efecte. La tesi es divideix en tres capítols. En el primer capítol, caracteritzem in vitro la unió i l’efecte funcional de Nb43 i Nb43-CGS21680 en sistemes cel·lulars que expressen mGlu5R i A2AR. En el segon capítol, avaluem la biodistribució,

penetració en el sistema nerviós central i activitat farmacològica d’aquests nanocossos en models murins. Finalment, en el tercer capítol, realitzem una metanàlisi de moduladors del metabolisme de l’adenosina en esquizofrènia i trastorn bipolar, per avaluar-ne l’impacte clínic i el potencial terapèutic. Els resultats de l’estudi in vitro del Nb43 van mostrar que Nb43 s’uneix selectivament a mGlu5R en un context fisiològic. D’altra banda, Nb43- CGS21680 va mostrar un perfil de doble acció, amb una modulació simultània de mGlu5R i A2AR. Curiosament, l’activació conjunta d’aquests receptors va resultar en una modulació més específica de l’activitat intracel·lular. Els experiments in vitro de PLA i NanoBiT van confirmar l’existència d’interaccions funcionals entre mGlu5R i A2AR, cosa que dona suport a la hipòtesi que aquests receptors formen heteròmers a la membrana neuronal. Per avaluar la biodistribució de Nb43, vam realitzar estudis d’imatge in vivo després de la seva administració intravenosa i intranasal. Els resultats van indicar que Nb43 no travessa la barrera hematoencefàlica de manera significativa quan s’administra per via intravenosa. No obstant això, en l’administració intranasal es van detectar petites concentracions al bulb olfactori, suggerint una possible via d’accés al sistema nerviós central. Els efectes conductuals de Nb43 i Nb43-CGS21680 es van avaluar després de la seva administració intracerebroventricular, cosa que va permetre analitzar l’impacte directe en el sistema nerviós central sense la limitació de la barrera hematoencefàlica. En la prova de locomoció, CGS21680 va reduir significativament l’activitat locomotora, en línia amb estudis previs que suggereixen el seu efecte anti-dopaminèrgic. De manera similar, Nb43 i Nb43- CGS21680 també van disminuir la locomoció, encara que amb menor intensitat. Aquest efecte suggereix que Nb43 i Nb43-CGS21680 podrien estar modulant la neurotransmissió dopaminèrgica a través de la seva acció sobre

mGlu5R a l’estriat. En la prova de catalepsia induïda per haloperidol, CGS21680 va augmentar significativament la catalepsia, confirmant-ne el paper en la inhibició dopaminèrgica. De manera interessant, Nb43 també va augmentar el temps de catalepsia, cosa que indica que el seu efecte sobre mGlu5R podria estar modulant l’activitat de la via dopaminèrgica. A diferència de CGS21680, els efectes del qual van desaparèixer a les 24-48 hores, Nb43-CGS21680 va prolongar l’efecte de catalepsia fins a 48 hores després de la seva administració, cosa que suggereix un mecanisme més sostingut de modulació de la neurotransmissió. Addicionalment, vam realitzar experiments de catalepsia després de l’administració intranasal de Nb43 i Nb43-CGS21680. Els resultats van mostrar que Nb43 va tenir un impacte significatiu en la catalepsia induïda per haloperidol, mentre que Nb43-CGS21680 no va mostrar efectes. Això suggereix que Nb43 podria haver arribat al SNC a través del bulb olfactori, on s’expressa mGlu5R i s’ha reportat el seu paper en la modulació de la locomoció i l’equilibri. D’altra banda, l’estudi de metanàlisi va incloure estudis clínics que van avaluar l’impacte de moduladors del metabolisme de l’adenosina, com l’al·lopurinol, el dipiridamol, la pentoxifil·lina i la propentofil·lina, en la simptomatologia de l’esquizofrènia i el trastorn bipolar. Els resultats van indicar que l’al·lopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa que eleva els nivells d’adenosina, va ser el més estudiat i va mostrar efectes positius en la reducció dels símptomes positius de l’esquizofrènia i el trastorn bipolar. El dipiridamol, un inhibidor de la recaptació d’adenosina, també va mostrar millores en els símptomes positius, encara que els estudis van ser limitats. La propentofil·lina, un derivat de les xantines amb propietats neuroprotectores i antiinflamatòries, va tenir efectes més marcats en els símptomes negatius i el deteriorament cognitiu.

Les troballes de la metaanàlisi reforcen la hipòtesi adenosinèrgica de l’esquizofrènia i el trastorn bipolar, la qual proposa que la modulació del sistema adenosinèrgic pot influir en la neurotransmissió dopaminèrgica i glutamatèrgica. En aquest sentit, els resultats suggereixen que estratègies dirigides a potenciar la senyalització adenosinèrgica podrien representar una via terapèutica prometedora. En conjunt, aquesta tesi contribueix al coneixement sobre el paper dels nanocossos en la farmacologia dels receptors de membrana i destaca la importància del sistema adenosinèrgic en la modulació de la neurotransmissió dopaminèrgica i glutamatèrgica en trastorns neuropsiquiàtrics.

[spa] Los trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia y el trastorno bipolar presentan alteraciones en la neurotransmisión dopaminérgica y glutamatérgica, lo que ha llevado al desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a estos sistemas. Recientemente, el sistema adenosinérgico ha emergido como un regulador clave de la actividad dopaminérgica y glutamatérgica, con evidencia de que la activación del receptor A2A de adenosina puede modular la transmisión dopaminérgica y afectar síntomas neuropsiquiátricos. Además, la interacción entre el receptor A2A y el receptor metabotrópico de glutamato tipo 5 en el estriado representa un punto de convergencia terapéutica potencial para el tratamiento de estos trastornos. En este contexto, los nanocuerpos han surgido como herramientas innovadoras para modular interacciones macromoleculares de membrana de manera altamente específica. A diferencia de los anticuerpos convencionales, los nanocuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena pesada que presentan ventajas como su pequeño tamaño, alta estabilidad y capacidad de acceder a regiones inaccesibles de las proteínas. En esta tesis, exploramos el desarrollo y la caracterización del nanocuerpo Nb43, diseñado para modular el receptor de glutamato mGlu5R, así como su conjugado Nb43-CGS21680, que incorpora un agonista de A2AR para potenciar su efecto. La tesis se divide en tres capítulos. En el primer capítulo, caracterizamos in vitro la unión y el efecto funcional de Nb43 y Nb43-CGS21680 en sistemas celulares que expresan mGlu5R y A2AR. En el segundo capítulo, evaluamos la distribución,

penetración en el sistema nervioso central y actividad farmacológica de estos nanocuerpos en modelos murinos. Finalmente, en el tercer capítulo, realizamos un metaanálisis de moduladores del metabolismo de adenosina en esquizofrenia y trastorno bipolar, para evaluar su impacto clínico y su potencial terapéutico. Los resultados del estudio in vitro del Nb43 mostraron que Nb43 se une selectivamente a mGlu5R en un contexto fisiológico. Por otro lado, Nb43- CGS21680 mostró un perfil de doble acción, con una modulación simultánea de mGlu5R y A2AR. Curiosamente, la activación conjunta de estos receptores resultó en una modulación más específica de la actividad intracelular. Los experimentos in vitro de PLA y NanoBiT confirmaron la existencia de interacciones funcionales entre mGlu5R y A2AR, lo que respalda la hipótesis de que estos receptores forman heterómeros en la membrana neuronal. Para evaluar la biodistribución de Nb43 y Nb43-CGS21680, realizamos estudios de imagen in vivo tras su administración intravenosa e intranasal. Los resultados indicaron que Nb43 no atraviesa la barrera hematoencefálica de manera significativa cuando se administra per vía intravenosa. Sin embargo, en la administración intranasal, se detectaron pequeñas concentraciones en el bulbo olfatorio, sugiriendo una posible vía de acceso al sistema nervioso central. Los efectos conductuales de Nb43 y Nb43-CGS21680 se evaluaron tras su administración intracerebroventricular, lo que permitió analizar su impacto directo en el sistema nervioso central sin la limitación de la barrera hematoencefálica. En la prueba de locomoción, CGS21680 redujo significativamente la actividad locomotora, en línea con estudios previos que sugieren su efecto anti-dopaminérgico. De manera similar, Nb43 y Nb43- CGS21680 también disminuyeron la locomoción, aunque con menor

intensidad. Este efecto sugiere que Nb43 podría estar modulando la neurotransmisión dopaminérgica a través de su acción sobre mGlu5R en el estriado. En la prueba de catalepsia inducida por haloperidol, CGS21680 aumentó significativamente la catalepsia, confirmando su papel en la inhibición dopaminérgica. De manera interesante, Nb43 también exacerbó la catalepsia, lo que indica que su efecto sobre mGlu5R podría estar modulando la actividad de la vía dopaminérgica. A diferencia de CGS21680, cuyos efectos desaparecieron a las 24-48 horas, Nb43-CGS21680 prolongó el efecto de catalepsia hasta 48 horas después de su administración, lo que sugiere un mecanismo más sostenido de modulación de la neurotransmisión. Adicionalmente, realizamos experimentos de catalepsia tras la administración intranasal de Nb43 y Nb43-CGS21680. Los resultados mostraron que Nb43 tuvo un impacto significativo en la catalepsia inducida por haloperidol, mientras que Nb43-CGS21680 no mostró efectos. Esto sugiere que Nb43 pudo alcanzar el sistema nervioso central a través del bulbo olfatorio, donde se expresa mGlu5R y se ha reportado su papel en la modulación de la locomoción y el equilibrio. Por otro lado, el estudio de metaanálisis incluyó estudios clínicos que evaluaron el impacto de moduladores del metabolismo de adenosina, como alopurinol, dipiridamol, pentoxifilina y propentofilina, en la sintomatología de la esquizofrenia y el trastorno bipolar. Los resultados indicaron que alopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa que eleva los niveles de adenosina, fue el más estudiado y mostró efectos positivos en la reducción de síntomas positivos y negativos de la esquizofrenia y transtorno bipolar. Dipiridamol, un inhibidor de la recaptación de adenosina, también mostró mejoras en síntomas positivos, aunque los estudios fueron limitados. Propentofilina, un derivado de xantinas con propiedades neuroprotectoras y

antiinflamatorias, tuvo efectos más marcados en síntomas negativos y deterioro cognitivo. Los hallazgos del metaanálisis refuerzan la hipótesis adenosinérgica de la esquizofrenia y el trastorno bipolar, la cual propone que la modulación de sistema adenosinérgico puede influir en la neurotransmisión dopaminérgica y glutamatérgica. En este sentido, los resultados sugieren que estrategias dirigidas a potenciar la señalización adenosinérgica podrían representar una vía terapéutica prometedora. En conjunto, esta tesis contribuye al conocimiento sobre el papel de los nanocuerpos en la farmacología de los receptores de membrana y destaca la importancia del sistema adenosinérgico en la modulación de la neurotransmisión dopaminérgica y glutamatérgica en trastornos neuropsiquiátricos.