Development of an in vitro LTP-model of food anaphylaxis and study of mechanisms driving exacerbated responses

Abstract

[eng] Mast cells (MCs), key immune system cells, can be activated via IgE or the MRGPRX2 receptor, releasing proinflammatory mediators that may trigger severe allergic reactions such as anaphylaxis. The study aims to better understand the cellular and molecular mechanisms governing these responses and to identify potential therapeutic targets.

This study develops an in vitro model of food allergy mediated by lipid transfer protein (LTP), focusing on the analysis of mast cell (MC) responses in patients with varying degrees of severity. Patients sensitized to Lipid transfer protein (LTP) were classified as anaphylaxis or sensitized depending on the symptoms elicited by LTP-containing food. CD34+-derived MCs from patients and controls were obtained, sensitized with pooled sera, and challenged with Pru p 3 (peach LTP).

MCs from anaphylactic patients exhibited increased degranulation and elevated secretion of PGD2, IL-8, and GM-CSF upon stimulation, which could be related to higher-affinity IgE, produced with the help of TFH13 cells, which were more abundant in those patients. In contrast, sensitized MCs showed a protective profile, with higher CCL2 and TGF-β production. At the molecular level, MCs from anaphylactic patients expressed higher levels of genes associated with cell activation, inflammation, and mitochondrial function, including the Microphthalmia-associated transcription factor (MITF). Further dissection shows that inhibition of MITF significantly reduced degranulation, calcium influx, mediator secretion, and mitochondrial activity.

In conclusion, allergic response severity is influenced by both humoral and cellular components. Beyond antibody-driven mechanisms, cellular factors such as MITF expression may amplify mast cell activation and exacerbate allergic reactions. Targeting MITF could represent a therapeutic strategy to reduce mast cell hyperactivation and mitigate severe allergic responses.

[cat] INTRODUCCIÓ Els mastòcits (MCs) són cèl·lules del sistema immune, implicades en la defensa de l'hoste, la immunitat innata i adquirida, les respostes homeostàtiques i la immunoregulació (Marshall 2004; Espinosa-Riquer et al. 2020; Bischoff 2007; Ansari, Kanagaratham, and Oettgen 2020). Diferents mecanismes indueixen l'activació dels mastòcits, com la unió entre la Immunoglobulina E (IgE), unida a l’al·lèrgen, i FcRI (Fc Epsilon Receptor) o la unió de fàrmacs amb el receptor MRGPRX2 (Mas related GPR family member X2, receptor acoblat a proteïnes G) (Navinés-Ferrer et al. 2018; McNeil 2021) causant l'alliberament immediat del contingut dels grànuls (Lecce et al. 2020; Anvari et al. 2019). Els mastòcits secreten una àmplia gamma de mediadors preformats i sintetitzats de novo, que desencadenen respostes al·lèrgiques com asma, angioedema, urticària, i en els casos més greus, anafilaxi o xoc anafilàctic (Bahri and Bulfone-Paus 2020; Tejedor Alonso, Moro Moro, and Múgica García 2015). En les últimes dècades, l'anafilaxi causada per aliments i fàrmacs, ha augmentat de manera crítica i el seu risc és impredictible. La dieta d’evitació d'al·lèrgens o el tractament simptomàtic són els tractaments estàndard per gestionar aquestes patologies; i, la prova de provocació oral amb al·lèrgens segueix sent la principal eina per diagnosticar al·lèrgies a aliments i medicaments, posant en risc la vida del pacient, ja que poden provocar reaccions al·lèrgiques potencialment greus, anafilaxi o fins i tot la mort (Bahri et al. 2018; Santos et al. 2020; Nicolaou and Custovic 2011). Així doncs, és realment necessari trobar un model in vitro que substitueixi la tècnica de provocació oral com a eina de diagnòstic per predir el risc de gravetat. Entendre les bases moleculars i cel·lulars de l'al·lèrgia alimentària ajudaria a desenvolupar un diagnòstic, una prevenció i un tractament més precís. Estudis recents en pacients al·lèrgics i models murins mostren que l’afinitat de la IgE i el paper de les cèl·lules TFH13 (T follicular helper 13 cells) són clau en la desgranulació mastòcitaria i l’anafilaxi (Akiyama et al. 2025; Tong et al. 2022; Gowthaman et al. 2019). Per altra banda, la funcionalitat dels mastòcits està regulada per diferents factors de transcripció, com ara el factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), el qual està implicat en la biogènesi dels mastòcits i la síntesi de mediadors (Guo et al. 2021), així com la producció d'ATP (Sharkia et al. 2017). HIPÒTESI Així doncs, la nostra hipòtesi és que en les reaccions anafilàctiques, tant els components humorals (IgE) com els cel·lulars (mastòcits) contribueixen a la gravetat de la malaltia. A més, el factor de transcripció associat a la microftàlmia (MITF), és un regulador clau de la diferenciació i l'activació dels mastòcits i pot representar una potencial diana terapèutica per al tractament de l'anafilaxi en reaccions dependents d’IgE o del receptor MRGPRX2. RESULTATS En aquest estudi hem utilitzat un model d'al·lèrgia alimentària relacionada amb la proteïna de transferència de lípids (LTP). La LTP és un “pan-alergen” present en diversos aliments vegetals (hortalisses, fruites, llegums, fruits secs, llavors,...) i és la principal causa d'al·lèrgia alimentària en adults en la regió mediterrània (Allergologia et al. 2001; Egger et al. 2010; Fernández-Rivas et al. 2003). L'al·lèrgia a la LTP té una àmplia gamma de símptomes, des de símptomes lleus fins a l'anafilaxi. Els pacients amb al·lèrgia a la LTP poden desenvolupar reaccions amb múltiples aliments vegetals, limitant la seva dieta i afectant la seva qualitat de vida (Scheurer, Van Ree, and Vieths 2021). Població d’estudi Per tal d’estudiar mecanismes en el model de la LTP, es van reclutar pacients al·lèrgics al Servei d'Al·lèrgies de l'Hospital Clínic de Barcelona. Es van classificar en dos grups en funció de la gravetat de la reacció a la ingestió de préssec: (a) pacients diagnosticats amb al·lèrgia a la LTP i amb antecedents d'anafilaxi a la història clínica, i (b) pacients sensibilitzats a la LTP, però sense símptomes o símptomes locals lleus. També es van reclutar voluntaris sans sense al·lèrgies respiratòries o alimentàries com a controls. Desenvolupament d'un model cel·lular (mastòcits) per distingir la severitat de la reacció al·lèrgica Primerament, vam poder establir un model d’al·lèrgia a la LTP in vitro que podia diferenciar els pacients amb reaccions greus vers els pacients que només estaven sensibilitzats a la LTP. El test d’activació de mastòcits (MAT) és una eina de diagnòstic in vitro que combina l’al·lergen, la IgE específica d'al·lergen i els MCs humans, els tres elements crucials de la fase efectora de les respostes al·lèrgiques mediades per IgE (Tam et al. 2020). Curiosament, en el nostre model, vam observar que els MCs de pacients anafilàctics induïen una major desgranulació i producció de prostaglandina D2 (PGD2) que els MCs dels pacients sensibilitzats. A més, vam observar que les LAD2 (línia cel·lular de mastòcits) incubades amb sèrum dels pacients anafilàctics també induïen una major desgranulació i producció de PGD2 que les LAD2 incubades amb sèrum de pacients sensibilitzats, suggerint que el sèrum (component humoral) dels pacients podia tenir un paper important en la severitat de la reacció. En aquesta línia, vam observar que les cèl·lules TFH13, encarregades d’induir la producció d’una IgE de més alta afinitat, eren més abundants en pacients amb anafilaxi que en aquells sensibilitzats, la qual cosa indica que els pacients anafilàctics podrien tenir una IgE específica de més alta afinitat que la dels pacients sensibilitzats. Diferències en el patró d'activació de mastòcits entre individus sensibilitzats i anafilàctics A més a més, vam observar que la sensibilització de les cèl·lules amb el sèrum dels pacients anafilàctics, seguida per l’activació de Pru p 3, induïa una major resposta proinflamatòria, augmentant la secreció de IL8 i GM-CSF. Per contra, la sensibilització de les cèl·lules amb el sèrum dels pacients sensibilitzats, seguida per l’activació de Pru p 3, induïa una resposta més protectora, augmentant la secreció de CCL2 i TGF-. A partir de la transcriptòmica de MCs sensibilitzats en sèrums de pacients i activats amb Pru p 3, vam observar que vies relacionades amb la secreció de citocines pro-inflamatòries estaven reduïdes en MCs sensibilitzats amb sèrum de pacients sensibilitzats i activades amb Pru p 3, suggerint una senyalització diferencial en comparació amb els MCs sensibilitzats amb sèrum de pacients anafilàctics i activats amb Pru p 3. Diferències en l’expressió gènica de mastòcits entre individus sensibilitzats i anafilàctics L’expressió gènica de diversos factors estava elevada en MCs de pacients anafilàctics en comparació amb els MCs de pacients sensibilitzats o individus sans. Vam observar una elevada expressió de: FcRI, un receptor crucial per l’activació dels MCs; la histidina decarboxilasa, una enzima important en la síntesi d’histamina; la triptasa Alpha/Beta 1, essencial per la producció de triptasa; la proteïna STIM1 (Stromal Interaction Molecule 1), que facilita l’entrada de calci, necessària per l’activació dels MCs; la translocasa de la membrana mitochondrial externa (TOMM20), implicada en la biogènesi mitocondrial i COX-IV, proteïna important per l’activitat mitocondrial. A més, també vam observar nivells elevats de mediadors pro-inflamatoris com la interleukina 1 beta (IL1-), la ciclooxigenasa 2 (COX2), crucial per la síntesi de prostaglandines; i el receptor de prostaglandines EP3 (PTGER3), que indueix l’activació dels MCs. Aquests resultats suggereixen que els pacients anafilàctics podrien tenir una predisposició a patir respostes més severes. Finalment, els mastòcits de pacients anafilàctics presentaven nivells elevats de MITF, un factor de transcripció que, com hem dit anteriorment, està implicat en la diferenciació dels MCs, així com en els mediadors de desgranulació i alliberació dels MCs (Goding and Arnheiter 2019). Vam observar que MITF és un factor clau en la regulació de la desgranulació mastocitària. Modulacions de l’expressió de MITF condicionen l’alliberació de mediadors pro-inflamatoris i l’activitat mitocondrial Vam observar que la inhibició de MITF podria disminuir la gravetat de la resposta al·lèrgica mitjançant la regulació de la secreció de mediadors dels mastòcits (preformats i de novo) i la funció mitocondrial. Quan MITF estava inhibit o silenciat, hi havia una disminució de la secreció de citoquines pro-inflamatòries (IL8 i GM-CSF), de l’expressió dels gens IL1-, COX2 i PTGER3, i de l’expressió de TOMM20 i COX-IV. Així com també, vam observar una disminució de la respiració mitocondrial quan MITF estava inhibit o silenciat. Resumint, hem observat que els MCs de pacients anafilàctics tenen una desgranulació més forta i una major alliberació de citoquines pro-inflamatòries, probablement causada per una activitat mitocondrial més elevada, una expressió més elevada de gens pro-inflamatoris, així com una secreció de mediadors pro-inflamatoris més elevada, en comparació amb els MCs de pacients sensibilitzats. A més, hem mostrat que aquesta resposta exacerbada es podria regular a la baixa amb el silenciament o la inhibició de MITF. Conclusions Els nivells i l'afinitat d'IgE tenen un paper crític en la gravetat de les reaccions al·lèrgiques. A més, l’expressió elevada de certs gens, com MITF, poden estar augmentant la susceptibilitat d’aquests MCs per induir una resposta exacerbada. MITF podria regular les respostes exacerbades dels mastòcits tant per la via depenent de la IgE com per la via depenent de MRGPRX2. Això obre una nova línia d’investigació per explorar: la implicació de MITF en la biologia dels mastòcits, destacant el seu potencial terapèutic en malalties inflamatòries i al·lèrgiques.