Análisis comparativo de la expresión de miRNAs en el desarrollo embrionario del colon, el cáncer colorectal y el linfoma de Hodgkin

Abstract

[spa] Los microRNAs (miRNAs) son unas pequeñas moléculas de RNA (20-25nt) que no codifican para proteína, sin embargo actúan inhibiendo la traducción a proteína de RNAs mensajeros mediante la unión a su región UTR 3'. Se ha visto que estos miRNAs juegan un papel esencial en la regulación de la diferenciación celular y en el mantenimiento del estado pluripotente en las células madre. De la misma manera se los ha visto desregulados en múltiples tumores, llegando a ser considerados en algunos casos oncogenes o genes supresores de tumores. En la presente tesis se realizado un análisis de la expresión de miRNAs maduros en dos modelos tumorales diferentes: por un lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en tejido tumoral y normal de pacientes afectos de cáncer colorectal y en muestras de colon embrionario humano de embriones de 7-12 semanas de desarrollo. Por otro lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en ganglios de pacientes afectos de linfoma de Hodgkin clásico y en ganglios normales. Para ello se han analizado un total de 156 miRNAs maduros mediante stem-loop RT-PCR y PCR a tiempo real(TaqMan). La validación de los resultados se ha realizado mediante el uso de líneas celulares (DLD1 de cáncer colorectal, y L-428, HD-MY-Z y L-1236 de linfoma de Hodgkin) y mediante hibridación in situ de miRNAs con sondas de tipo LNA(Exiqon) en la plataforma automática Bond Max (Vision Biosystems). En el análisis del cáncer colorectal y la embriogénesis del colon se ha detectado una expresión solapada de miRNAs entre la mucosa colónica embrionaria y el cáncer colorectal. Se ha determinado una firma de miRNAs que caracteriza al cáncer colorectal de estadio I y II. Se ha definido también el patrón de expresión de miRNAs durante la embriogénesis del colon. Además hemos demostrado que el cluster de miRNAs miR-17-92 y su proteína diana E2F1 comparten un patrón de expresión común entre la embriogénesis del colon humano y la carcinogénesis colorectal, actuando en la regulación del proceso de proliferación celular. En este sentido, la hibridación in situ confirmó la sobreexpresión de miR-17-5p en la base de las criptas colónicas, en el compartimiento proliferativo. Por otro lado, en el estudio del patrón de expresión de miRNAs en el linfoma de Hodgkin clásico (LHc), se ha encontrado una firma de 25 miRNAs que caracterizan a este LHc. Entre estos miR-21, miR-134 y miR-138 mediante hibridación in situ se los ha detectado en el citoplasma de las células de Hodgkin/Reed Sternberg (H/RS). La validación de los 25 miRNAs en las líneas celulares ha demostrado que 20 son expresados por las líneas celulares y únicamente 5 son de expresión exclusiva del microambiente reactivo. Por otro lado se han definido 32 miRNAs que permiten discriminar entre el subtipo histológico esclerosis nodular, del subtipo celularidad mixta, de los cuales 11 mostraban diferencias que caracterizaban a las células tumorales de un tipo u otro. Además se analizó si la presencia del virus de Epstein Barr (EBV) estaba alterando el patrón de miRNAs en los pacientes de LHc EBV+ respecto a los EBV-, y se encontraron un conjunto de 10 miRNAs diferencialmente expresados entre los dos grupos de pacientes. Finalmente se vio que miR-138 estaba sobreexpresado en estadios iniciales (I-II) y se infraexpresaba en estadios avanzados (III-IV). Los miRNAs se deben considerar como moléculas claves tanto en la embriogénesis del colon, como en la transformación neoplásica del epitelio colónico, así como en el LHc, pudiendo ser utilizadas en un futuro como herramienta terapéutica.

[eng] MicroRNAs (miRNAs) are negative regulators of gene expression that play an important role in hematopoiesis and tumorigenesis and have been shown to be essential to regulate cell differentiation and maintenance of the pluripotent cell state.To date, no evidence has linked miRNA expression in embryonic and tumor tissue. We assessed the expression of mature miRNAs in human embryonic colon tissue and in colorectal cancer and paired normal colon tissue. Overlapping miRNA expression was detected between embryonic colonic mucosa and colorectal cancer. We demonstrated that miR-17-92 cluster and expression of its target E2F1 share a common pattern between human colon embryogenesis and colonic carcinogenesis, regulating the proliferation process. In this sense, in situ hybridization assay confirmed the overexpression of miR-17-5p in the crypt progenitor compartment. miRNAs pathways must be considered to be included as major players contributing to both embryonic development and neoplastic transformation of colonic epithelium. In other hand, we analyzed miRNA expression in classic Hodgkin lymphoma (cHL) and the influence of Epstein-Barr virus (EBV) infection on the miRNA expression profiles. The expression of 157 miRNAs in lymph nodes from 49 cHL patients and 10 reactive lymph nodes (RLNs) was analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Hierarchic clustering revealed 3 well-defined groups: nodular sclerosis cHL, mixed cellularity cHL, and RLNs. A distinctive signature of 25 miRNAs differentiated cHL from RLNs, and 36 miRNAs were differentially expressed in the nodular sclerosis and mixed cellularity subtypes. These results were validated in a set of 30 cHLs and 5 RLNs, and in 3 cHL cell lines. miR-96, miR-128a, and miR-128b were selectively down-regulated in cHL with EBV. Our findings suggest that miRNAs play an important role in the biology of cHL and may be useful in developing therapies targeting miRNAs.