Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

URI permanent per a aquesta col·leccióhttps://hdl.handle.net/2445/36137

Estadístiques

Examinar

Mostrant 1 - 20 de 157

Mechanisms of the Asc1 amino acid transporter
(Universitat de Barcelona, 2024-07-04) Rullo Tubau, Josep; Palacín Prieto, Manuel; Errasti-Murugarren, Ekaitz; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] The Asc1 amino acid transporter is involved in several basic processes of the central nervous system, such as N-methyl-D-aspartate receptor mediated excitation and glycinergic inhibition of signal transmission, having thus potential as a therapeutic target to treat neurological disorders such as schizophrenia, amyotrophic lateral sclerosis and hyperekplexia. In the present project, we aimed to determine the high-resolution atomic structure of Asc1 in complex with CD98hc using Cryo-EM and to dissect the molecular mechanisms that underlie its transport function, therefore laying the groundwork for future research to develop more efficient drugs against the aforementioned neurological disorders. The structure of the Asc1/CD98hc complex has been determined at a resolution of 4 Ǻ, with local resolution reaching 3.4-3.8 Ǻ for most of the map. The transporter has been captured in a hitherto unknown semi- occluded conformation, in which the transmembrane helix (TM) 1a is in an intermediate position between a transporter fully open to the cytosol and one completely occluded. Interestingly, in this apo structure a connection can be observed between the bundle (TM1, 2, 6, 7) and scaffold (TM3, 4, 5, 8, 9, 10) domains through a polar contact between Ser 246 (TM6) and Tyr 333 (TM8). Recalling previous studies with prokaryotic homologues, which proved the importance of this kind of interactions between domains for substrate translocation, the functional relevance of the Ser 246 – Tyr 333 was studied. Although the Cryo-EM structure was obtained from a protein preparation incubated with 10 mM D-serine the resulting structure was in a substrate- free apo state. To surmount this limitation, Protein Energy Landscape Exploration (PELE) was carried out with the newly determined Asc1 structure, allowing us to identify a series of residues key for determining substrate selectivity in Asc1: Ser 56, Ser 246 and Tyr 333. The impact of mutating these residues on the uptake of radiolabelled substrate was measured, revealing that all three residues are essential for the transport of the canonical Asc1 substrates, i. e., small neutral amino acids, but not larger substrates. Moreover, the impact of mutating these residues on both modes of transport presented by Asc1, exchange and facilitated diffusion, was assessed. Efflux experiments in HeLa cells with the mutants S246G and Y333F revealed that these residues are essential for exchange, but also result in a slower inward return of the empty transporter, thus supporting also a role of Ser 246 and Tyr 333 in sustaining facilitated diffusion. Molecular dynamics of L-alanine binding in our structure largely confirmed the observations from the PELE analysis although, surprisingly, in one of the trajectories TM1a opened the cytosolic vestibule and the substrate was released to the cytosol. In this replica, initially Tyr 333 competed with Ser 56 for binding with the substrate carboxyl. The rotation of Tyr 333 towards TM6 dragged the substrate away from the unwound region of TM1, and upon disconnection of the substrate from TM1, TM1a started to open the cytosolic gate. The binding of the side chain of Ser 246 to L-alanine, which we had also observed in one of the PELE poses, could be stabilising an intermediate stage in which Tyr 333 has rotated towards TM6 but the substrate remains bound to Ser 56. We propose a model in which the interaction of the substrate with the side chains of Ser 246 and Tyr 333 allows its proper positioning between the unwound regions of TM1 and TM6 to trigger translocation. This model is supported by kinetic analysis of L-alanine and D-serine uptake of the mutants S246G and Y333F, which decrease the maximal velocity of the transporter.
Nanopartícules dirigides a cèl·lules mare CXCR4+ per al tractament de la leucèmia mieloide aguda
(Universitat de Barcelona, 2023-04-12) Núñez Amela, Yáiza; Manques Bufalluy, Ramon, 1957-; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[cat] La leucèmia mieloide aguda (LMA) és un grup heterogeni de malalties hematològiques que s'originen a partir de la proliferació clonal excessiva de cèl·lules precursores mieloides. Actualment, malgrat que la majoria de pacients inicialment responen al tractament, aproximadament dos terços pateixen recaigudes. En els últims anys, les cèl·lules mare leucèmiques (LSC) han tingut un especial interès a causa de les evidències que indiquen que són les principals responsables de la quimioresistència i les recaigudes. Per aquesta raó, és necessari erradicar selectivament les LSC amb noves estratègies terapèutiques dirigides que permetin superar la resistència a fàrmacs i millorar l’eficàcia del tractament reduint-ne els efectes secundaris. El present estudi es basa en l’ús de nanopartícules dirigides específicament al receptor de superfície CXCR4, el qual es troba sobreexpressat en aproximadament la meitat dels pacients amb LMA (CXCR4+), fet que s’ha relacionat amb mal pronòstic i un major risc de recidiva. En concret, en aquesta tesi s’estudien les nanotoxines polipeptídiques T22-DITOX-H6 i T22-PE24-H6, que contenen el domini de translocació i catalític de l’exotoxina diftèrica de Corynebacterium diphtheriae i el domini catalític desimmunitzat de l’exotoxina A provinent de Pseudomonas aeruginosa, respectivament. Ambdues toxines tenen la capacitat d’inactivar el factor d’elongació-2 eucariòtic, produint la inhibició de la síntesi proteica que, conseqüentment, provoca la mort cel·lular. L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral és avaluar la capacitat de les nanotoxines polipeptídiques T22-DITOX-H6 i T22-PE24-H6 d’eliminar selectivament les LSC CXCR4+ i de produir efecte antineoplàstic mitjançant la seva internalització a través del receptor CXCR4. Primerament, determinant l’efecte antineoplàstic de les nanotoxines polipeptídiques T22-DITOX-H6 i T22-PE24-H6 en línies cel·lulars de LMA, en models murins disseminats i en mostres de medul·la òssia (MO) de pacients amb LMA. Finalment, avaluant la relació entre l’expressió de CXCR4 i el fenotip LSC en les mostres de pacients de LMA. Els resultats obtinguts demostren que les nanotoxines avaluades exerceixen un potent efecte citotòxic in vitro en línies cel·lulars de LMA i que aquest és dependent de CXCR4 i està mediat per la inducció d'apoptosi. A més, l'administració intravenosa de dosis repetides, tant de T22-DITOX-H6 com de T22-PE24-H6 en models murins disseminats de LMA, indueix un potent efecte antineoplàstic in vivo, que redueix significativament la disseminació de la LMA, disminuint la càrrega leucèmica de les cèl·lules CXCR4+ sense toxicitat sistèmica associada. Altrament, en aquesta tesi doctoral s’ha comprovat que l’especificitat citotòxica de la nanotoxina T22-PE24-H6 sobre les cèl·lules de la LMA CXCR4+, provoca una reducció significativa de la viabilitat cel·lular en les mostres de pacients de LMA amb una alta expressió de CXCR4, però no té cap efecte en aquelles mostres amb baixa expressió de CXCR4 ni en una mostra de MO de donant sa. Convé destacar que els resultats obtinguts han evidenciat que el receptor CXCR4 es troba sobreexpressat en aquelles cèl·lules amb fenotip LSC, CD34+CD38-CD123+, i que la seva expressió correlaciona amb la de CD123, un marcador característic de LSC. Finalment, s’ha generat i validat un model PDX (Patient Derived Xenograft) derivat d’una mostra de MO CXCR4+ d’un pacient amb LMA, on poder avaluar posteriorment l’efecte de les nanotoxines dirigides a CXCR4. En resum, en aquesta tesi es proposa una nova teràpia basada en nanotoxines pel lliurament selectiu d’exotoxines bacterianes citotòxiques a les cèl·lules de LMA que sobreexpressen el receptor de superfície CXCR4, obrint una oportunitat terapèutica capaç d’eliminar selectivament les LSC, un subcompartiment cel·lular clau en la progressió de la LMA. Per això, aquesta teràpia selectiva milloraria el tractament actual dels pacients que pateixen LMA i que presenten sobreexpressió del receptor CXCR4, un subgrup de pacients amb major risc de presentar recaigudes i resistència a la quimioteràpia
New computational methods for structural modeling protein-protein and protein-nucleic acid interactions
(Universitat de Barcelona, 2023-04-18) Rodríguez Lumbreras, Luis Ángel; Fernández-Recio, Juan; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] The study of the 3D structural details of protein-protein and protein-DNA interactions is essential to understand biomolecular functions at the molecular level. Given the difficulty of the structural determination of these complexes by experimental techniques, computational tools are becoming a powerful to increase the actual structural coverage of protein-protein and protein-DNA interactions. pyDock is one of these tools, which uses its scoring function to determine the quality of models generated by other tools. pyDock is usually combined with the model sampling methods FTDOCK or ZDOCK. This combination has shown a consistently good prediction performance in community-wide assessment experiments like CAPRI or CASP and has provided biological insights and insightful interpretation of experiments by modeling many biomolecular interactions of biomedical and biotechnological interest. This software combination has demonstrated good predictive performance in the blinded evaluation experiments CAPRI and CASP. It has provided biological insights by modeling many biomolecular interactions of biomedical and biotechnological interest. Here, we describe a pyDock software update, which includes its adaptation to the newest python code, the capability of including cofactor and other small molecules, and an internal parallelization to use the computational resources more efficiently. A strategy was designed to integrate the template-based docking and ab initio docking approaches by creating a new scoring function based on the pyDock scoring energy basis function and the TM-score measure of structural similarity of protein structures. This strategy was partially used for our participation in the 7th CAPRI, the 3rd CASP-CAPRI and the 4th CASP-CAPRI joint experiments. These experiments were challenging, as we needed to model protein-protein complexes, multimeric oligomerization proteins, protein-peptide, and protein-oligosaccharide interactions. Many proposed targets required the efficient integration of rigid-body docking, template-based modeling, flexible optimization, multi- parametric scoring, and experimental restraints. This was especially relevant for the multi- molecular assemblies proposed in the 3er and 4th CASP-CAPRI joint experiments. In addition, a case study, in which electron transfer protein complexes were modelled to test the software new capabilities. Good results were achieved as the structural models obtained help explaining the differences in photosynthetic efficiency between red and green algae.
Papel de la proteína quinasa de la Distrofia Miotónica (DMPK) en músculo esquelético y cardíaco. Implicación en la patofisiología de la Distrofia Miotónica de tipo 1
(Universitat de Barcelona, 2009-11-04) Llagostera Martín, Esther; Kaliman, Perla; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[spa] Es conocido que la resistencia a la insulina es un estado fisiológico previo al desarrollo de diabetes de tipo 2. En pacientes de Distrofia miotónica (DM1) se ha descrito clínicamente la afectación a este nivel [Harper, 2001]. Con frecuencia los pacientes muestran niveles basales normales de insulina pero liberan cantidades excesivas de la misma tras una carga de glucosa [Cuthworth & Walter, 1975], evento que indica que existe una respuesta compensatoria de la célula beta, productora de insulina, a la insensibilidad de los tejidos a la hormona. A pesar de estos datos, una relación directa entre DMPK y la señalización de la insulina no había sido estudiada. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran la participación de DMPK en la captación de glucosa inducida por insulina en músculo cardíaco. Los ratones deficientes en DMPK (dmpk-KO) muestran una disminución en la vía de señalización de la insulina en el tejido muscular pero no en el hepático ni el adiposo, donde DMPK no se expresa. Los ratones dmpk-KO muestran defectos metabólicos tales como alteraciones en la tolerancia a la glucosa y disminución del transporte de glucosa al interior de las células musculares (esqueléticas y cardíacas). Estos resultados indican que la reducción en la expresión de DMPK podría estar relacionada con la resistencia a insulina presentada en los pacientes de DM1. Los resultados obtenidos muestran que a pesar de que el nivel de expresión del receptor de insulina en los animales dmpk-KO es normal, la unión de insulina a la membrana plasmática de los cardiomiocitos está disminuida, la sobre-expresión de las formas de DMPK mutadas K110A (sin actividad quinasa) y ¿MA (extremo C-terminal delecionado) conducen a la retención del receptor de insulina en compartimentos intracelulares y que la sobre-expresión de la forma salvaje de DMPK aumenta el porcentaje de receptor de insulina en la superficie celular. En conjunto estos datos parecen indicar que la proteína DMPK se encuentra implicada en el tráfico intracelular del receptor de insulina, asimismo indican que DMPK podría representar un factor de susceptibilidad para la diabetes de tipo 2. Dado que una de las características clínicas de la DM1 es la resistencia a la insulina así como un aumento en la deposición de grasa visceral se ha evaluado el papel de DMPK como un factor de riesgo para el desarrollo de la obesidad inducida por dieta sometiendo a los animales deficientes en DMPK a una dieta rica en grasas. Los animales sometidos a la dieta grasa aumentaron más su peso y sus depósitos de tejido adiposo. También observamos un empeoramiento en la respuesta de los animales deficientes para DMPK al test de tolerancia a la insulina, algo que no se había observado en dieta estándar, y que es indicativo del aumento de la resistencia sistémica a la insulina. Los resultados obtenidos indican que la deficiencia de DMPK facilita la aparición de un estado metabólico prediabético (resistencia a la insulina y el aumento de grasa visceral) cuando se produce un estrés metabólico como es el consumo de un exceso grasas en la dieta agravando el ya alterado fenotipo de los ratones dmpk-KO. El sobrepeso y la obesidad llevan con frecuencia a anormalidades metabólicas, resistencia a insulina, diabetes de tipo 2, desórdenes lipídicos y enfermedad cardiovascular. Todas ellas características fenotípicas encontradas con frecuencia en pacientes de DM1. En este contexto los datos obtenidos apuntan a la necesidad de una terapia nutricional médica para la prevención y gestión de los riesgos cardiometabólicos en los pacientes de DM1.
Estudio estructural y funcional del regulador transcripcional de la resistencia a la meticilina en Staphylococcus aureus, Mec1
(Universitat de Barcelona, 2006-04-18) García Castellanos, Raquel; Gomis Rüth, F. Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[spa] Esta tesis doctoral está centrada en el trabajo realizado sobre el regulador transcripcional de la resistencia a meticilina en Staphylococcus aureus, Mec1, y se ha concebido como la integración de tres trabajos publicados en revistas científicas. En primer lugar se desarrolla una introducción en la que, paulatinamente, se presenta la importancia biomédica de la proteína en cuestión y la complejidad del sistema de regulación del que forma parte. Posteriormente se describen los objetivos que nos planteamos para esta tesis doctoral. En el apartado de resultados se presentan las tres publicaciones derivadas del trabajo realizado sobre Mec1, precedidas cada una de una breve introducción y de un corto resumen de los resultados que describen. A continuación se realiza una discusión general de las informaciones concernientes a Mec1 que se desprenden del conjunto de publicaciones presentadas. La discusión va seguida de las conclusiones finales del trabajo. Finalmente, en los anexos 1 y 2 se muestran aquellos resultados para los que en los artículos científicos nunca hay espacio, pero que no por ello dejan de ser ilustrativos. Además, durante la duración de mi doctorado he participado en otros proyectos que han dado lugar a otros artículos científicos, y que incluyo en el anexo 3.
Computational Infrastructures for biomolecular research
(Universitat de Barcelona, 2019-12-03) Codó Tarraubella, Laia; Gelpí Buchaca, Josep Lluís; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] Recently, research processes in Life sciences have evolved at a rapid pace. This evolution, mainly due to technological advances, offers more powerful equipment and generalizes the digital format of research data. In the data deluge context, we need to overcome the current tsunami of data and prepare for the future. The current model, consisting to regularly add hardware resources into centralized core facilities without global coordination, is no longer sustainable. Scientific data management and analysis should be enhanced in order to offer services and developments corresponding to the new e-Science uses, and infrastructures are the vehicles to achieve so. We propose and implement research support infrastructures in line with new science directives, adapting them to the scenarios presented by the divergent use cases. Three different domain-specific infrastructures framed in three different scientific projects are assembly and introduced in this dissertation. The first case is framed in the clinical data management field, and focuses on the data platforms build around two epidemiologic case studies on Immune Mediated Inflammatory diseases (IMIDs), IMID-clinica and IMID-longitudinal. Making the leap to infrastructures more oriented to analysis process support, the transPLANT infrastructure represents a first intrusion into the topical cloud computing model. It is focused on plant genomics and its design became the seed for a more integrative cloud-based solution, this time developed for the non-programmer’s members of the 3D/4D genomics community. MuGVRE is the front cover of the resulting platform. Becoming obvious the transversal potential of cloud-based computational infrastructures as virtual research environments, openVRE is implemented as an abstraction of MuGVRE. It offers a vanilla platform encompassing computation, data and administration services ready to be adopted and customized by other scientific communities. They all represent an opportunity to establish better research processes through enhanced collaboration, data management, analysis practices and resources optimization.
Implicacions fisiopatològiques de l'alteració del transportador concentratiu de nucleòsids hCNT1
(Universitat de Barcelona, 2019-11-29) Mata i Ventosa, Aida; Pastor Anglada, Marçal; Pérez Torras, Sandra; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[cat] L’entrada de nucleòsids a la cèl·lula està regulada pels transportadors concentratius de nucleòsids (hCNTs, família gènica SLC28) i transportadors equilibratius de nucleòsids (hENTs, família gènica SLC29). S’ha descrit que l’expressió dels hCNTs disminueix en càncer, sobretot hCNT1. La restitució d’hCNT1 en models tumorals indueix canvis a la cèl·lula de caràcter supressor de tumor, i es donen independentment de la seva capacitat transportadora; per aquest motiu està classificat com a transceptor. Així, s’ha hipotetitzat que la desregulació d’hCNT1 és un esdeveniment primerenc en el procés de carcinogènesi. Per tant, l’objectiu principal d’aquesta tesi és elucidar els mecanismes de regulació d’hCNT1. Es va estudiar la base genètica de l’uridina-citidinúria en un pacient que presentava febre, hepatosplenomegàlia, acidosi làctica persistent, alteracions dels enzims hepàtics i que finalment va morir per fallada multiorgànica. Es van identificar les variants c.1528C>T (p.R510C) i c.1682G>A (p.R561Q) del gen SLC28A1 (hCNT1). L’anàlisi funcional d’aquestes variants va mostrar que afecten l’estructura tridimensional d’hCNT1, alteren el patró de glicosilació i disminueixen la vida mitjana dels mutants, comprometent l’activitat d’hCNT1. La co-transfecció d’ambdues variants, emulant la disposició al·lèlica trans del pacient, va mostrar disminució de l’activitat d’hCNT1. Un anàlisi posterior va identificar dues variants patogèniques del gen PRF1, indicant que el pacient també tenia Limfohistiocitosi Hemofagocítica Familiar tipus 2. Per tant, el pacient presentava un fenotip agreujat per la co-existència de dos defectes monogènics. En un estudi previ del grup utilitzant MYTH s’havia identificat l’E3 lligasa RNF41 com a proteïna d’interacció d’hCNT1. L’anàlisi del possible paper fisiològic va mostrar que la modulació d’RNF41 induïa canvis en l’activitat d’hCNT1, de manera que es va hipotetitzar que RNF41 ubiqüitinava hCNT1. Estudis d’inhibició del proteasoma amb hCNT1K19R (la lisina candidata mutada) no van mostrar canvis respecte hCNT1 WT. La interacció podria tenir altres funcions, com promoure el reciclatge d’hCNT1. Per altra banda, la pèrdua d’expressió dels hCNTs en càncer va propiciar l’estudi dels mecanismes de regulació dels gens corresponents. Així, es va determinar que l’estat de l’epigenoma condicionava l’expressió dels transportador, concretament l’acetilació de les histones. Es va tractar un panell de línies cel·lulars tumorals amb SAHA, un inhibidor d’histona desacetilases, i es va detectar increment de l’expressió dels transportadors hCNT1 i hCNT2 a temps curts que es traduïa en un augment d’activitat dependent dels hCNTs. Per estudiar els elements que podrien regular l’expressió d’hCNT1 es va clonar la regió promotora del gen SLC28A1, l’activitat del qual depèn del context cel·lular. La regió amb major activitat promotora corresponia a un fragment de 400pb situat 1695pb downstream respecte l’inici de transcripció (TSS). Es van identificar els factors de transcripció STAT3, YY1, KLF6, p53 i E2F1 com a candidats a la regulació d’SLC28A1. Es va detectar que l’estat de p53 condicionava l’activitat del promotor d’SLC28A1. L’expressió heteròloga de KLF6 produïa una tendència d’increment d’expressió d’hCNT1 a nivell d’mRNA i cert augment del transport concentratiu. Es va identificar que KLF6 s’unia al promotor d’SLC28A1 a -470pb respecte el TSS. Per últim, s’ha relacionat l’eix CDK4-pRb-E2F1 amb l’expressió dels transportadors de nucleòsids. La inhibició de CDK4 amb abemaciclib produïa un augment d’expressió a nivell d’mRNA dels transportadors concentratius a temps curts, mentre que l’expressió d’hENT1 disminuïa. Per hCNT1 i hENT1 aquests canvis eren efectuats per E2F1, el qual s’ha demostrat que s’uneix al promotor d’SLC28A1 i SLC29A1. En silenciar E2F1, l’expressió d’hCNT1 i hENT1 augmentava, mentre que en sobreexpressar-lo, l’expressió d’hCNT1 era disminuïda. Per tant, E2F1 podria estar contribuint a la regulació de l’expressió coordinada dels transportadors hCNT1 i hENT1.
Diagnòstic molecular de biomarcadors predictius en pacients amb càncer de pulmó de cèl·lula no petita
(Universitat de Barcelona, 2019-11-25) Clavé Safont, Sergi; Salido Galeote, Marta; Arriola Aperribay, Edurne; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[cat] El càncer de pulmó de cèl·lula no petita (CPCNP) es pot definir a nivell molecular per les alteracions genètiques que es produeixen en múltiples oncogens, inclosos els reordenaments dels gens ALK i ROS1. Per optimitzar el maneig clínic, el perfil molecular ha d'estar disponible per a tots els pacients per tal de fer accessibles les teràpies dirigides mitjançant tractaments inhibidors específics. Des de 2011, el test estàndard per detectar els reordenaments d’ALK i ROS1 ha estat la hibridació in situ fluorescent (FISH) utilitzant sondes de trencament i més endavant es va estandarditzar la detecció de sobreexpressió per immunohistoquímica (IHQ). Les dues tècniques tenen limitacions i han d'usar-se dins d'un context diagnòstic apropiat després de validacions per part del laboratori. En aquesta tesi doctoral es va confirmar la baixa prevalença dels reordenaments del gen ROS1 en la població espanyola i es va identificar una alta prevalença de les alteracions del nombre de còpies de ROS1 en els casos no reordenats sense que afectés a l'expressió de la proteïna ROS1 ni presentés implicacions clíniques associades en els pacients. Més recentment, l'ús de panells de seqüenciació massiva (NGS) per avaluar múltiples anomalies genòmiques clínicament rellevants ha demostrat ser viable per a la detecció d'aquests reordenaments genètics en les mostres d'adenocarcinoma de pulmó. La comparació amb les tècniques prèviament estandarditzades de FISH i IHQ s'ha investigat en el present treball de tesi doctoral per a la seva aplicació clínica. S'han trobat discrepàncies entre les tècniques, especialment en els casos ALK i ROS1 reordenats amb patró de FISH positiu per senyals 3 ' extra. Com l'efectivitat de les teràpies dirigides contra les cinases d’ALK i ROS1 depèn de la correcta selecció dels pacients segons les seves alteracions moleculars, proposem que es detalli en l'informe de resultats els patrons de FISH en el cas de positivitat. A més, segons els nostres resultats, la tècnica de NGS representa un enfocament pràctic i fiable a nivell clínic per a la detecció d’aquests reordenaments en el seu ús en mostres de teixit procedent de pacients amb CPCNP. Aquesta nova metodologia també permet avaluar en paral·lel els possibles mecanismes de resistència genètics relacionats amb les teràpies dirigides i facilitar l’accés dels pacients al tractament més adequat.
Molecular studies of two methylerythritol 4-phosphate pathway enzymes of isoprenoid biosynthesis : the 4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kinase and the 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase = Estudios moleculares de dos enzimas de la ruta del metileritritol 4-fosfato de biosíntesis de isoprenoides : la 4-difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol quinasa y la 1-dexosi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa
(Universitat de Barcelona, 2009-12-09) Giménez Oya, Víctor; Imperial Ródenas, Santiago; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[spa] Los isoprenoides son una de las mayores familias de compuestos descritos en la naturaleza. Estos compuestos están presentes en todos los organismos vivos y se sintetizan a partir de dos moléculas de 5 átomos de carbono: el isopentenil difosfato (IPP) y el dimetilalil difosfato (DMAPP). Actualmente se conoce que arqueobacterias, hongos y animales presentan la ruta del mevalonato de síntesis de estos precursores, mientras que eubacterias, algún protozoo (como el causante de la malaria) y protistas presentan la ruta del metileritritol 4-fosfato (MEP) de síntesis de IPP y DMAPP. Estas rutas coexisten separadas espacialmente en plantas, helechos y algunas algas. La ruta del MEP de biosíntesis de los precursores de isoprenoides se muestra como una atractiva diana para la búsqueda de nuevos compuestos antimaláricos, antibióticos y herbicidas debido a su presencia en los principales agentes patogénicos y su ausencia en animales, además del carácter esencial de los isoprenoides para la vida. En esta tesis se ha realizado la búsqueda asistida por ordenador de compuestos que puedan interferir en la formación del complejo homodimérico del cuarto paso enzimático de la ruta del MEP. La metodología utilizada es muy útil en la búsqueda de inhibidores específicos. Se han caracterizado la unión de diferentes compuestos obtenidos con la enzima. Además se ha caracterizado el estado de oligomerización de la enzima. Paralelamente también se ha caracterizado un homólogo del primer paso enzimático de la ruta del MEP de un organismo termofílico caracterizando sus principales parámetros cinéticos y residuos importantes para la actividad enzimática mediante mutagénesis dirigida. Como último punto, se ha caracterizado el proceso de proteólisis de diferentes homólogos de este primer paso enzimático de la ruta del MEP asociándolo a modificaciones postraduccionales intramoleculares de las mismas proteínas, abriendo la posibilidad de un proceso de regulación posttraduccional de la actividad enzimática en este tipo de enzimas.
Caracterización a nivel molecular de los genes 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa y 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa de Arabidopsis thaliana
(Universitat de Barcelona, 2003-04-11) Carretero Paulet, Lorenzo; Boronat i Margosa, Albert; Campos Martínez, Narciso; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biomedicina Molecular
[spa] Los isoprenoides (o terpenoides) constituyen una vasta familia de compuestos de muy diversa naturaleza estructural y funcional presentes en todos los seres vivos. Los isoprenoides sintetizados por las plantas representan la inmensa mayoría de los 29000 identificados hasta el momento, constituyéndose en la mayor familia de productos naturales conocidos. Esta gran variedad de estructuras y funciones resulta tanto más asombrosa cuando descubrimos que todos ellos, independiente de su origen, derivan del mismo intermediario común, el isopentenil pirofosfato (IPP, C5). Estructura química y función biológica son los criterios por los que han venido clasificándose convencionalmente todos los compuestos isoprenoides. Así, entre los que podríamos clasificar como primarios se incluyen algunos metabolitos esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta. Por su parte, conformando los denominados metabolitos secundarios aparecen compuestos isoprenoides con funciones no esenciales, y con frecuencia específicos de determinados grupos de plantas. La unidad más sencilla a partir de la cual se forman los restantes terpenoides es referida como isopreno, de ahí el origen etimológico del término isoprenoide para referirse colectivamente a estos compuestos, caracterizados muchos de ellos por la capacidad de descomponerse térmicamente. Muchos de estos compuestos eran conocidos y apreciados desde muy antiguo como aromatizantes, substancias medicinales, perfumes, pigmentos o narcóticos. Consecuentemente, numerosos productos isoprenoides representan un indudable interés económico. Entre ellos destacan el caucho, aromas como el de la uva variedad moscatel, el mentol o el limoneno, nutraceúticos como las vitaminas A, D3, K y E o los fitoesteroles y compuestos farmacológicamente activos como el taxol o la digitonina. Recientemente han sido registrados los carotenos licopeno y luteína como agentes oncoprotectores. Animales, hongos y arqueobacterias sintetizan el IPP en exclusiva a partir del acetil-CoA a través de la ruta del mevalonato (MVA). De hecho, esta ruta, descubierta en los años 50, se consideraba proveedor único para la síntesis del intermediario común a todos los isoprenoides también en organismos fotosintéticos y eubacterias. Sin embargo, la última década ha sido testigo del descubrimiento de una nueva vía de síntesis de IPP. Esta nueva vía biosintética, recientemente bautizada como del MEP, fue puesta de manifiesto originalmente en eubacterias y ha sido confirmada en diversos organismos autótrofos fotosintéticos, como las plantas superiores, las algas (excepción hecha de las euglenofitas) o las briofitas. Nuestro grupo ha sido pionero, en colaboración con el del Dr. Rohmer de la “Université Louis Pasteur” de Estrasburgo, en verificar la existencia de la ruta MEP en plantas, probablemente una de las últimas grandes ruta anabólicas por dilucidar. Adicionalmente, esta ruta ha sido confirmada también en los apicoplastos del organismo responsable de la malaria (Plasmodium falciparum) , así como en otros muchos organismos patógenos. Por todo ello, esta nueva ruta se erige en una diana ideal para el desarrollo de nuevos herbicidas y antibióticos. A pesar de la importancia de las funciones señaladas desempeñadas por los isoprenoides, y del evidente interés que despierta su estudio, muchos aspectos de la bioquímica de estos productos y en particular de la regulación de su propia biosíntesis son relativamente poco conocidos, particularmente en lo que se refiere a aquellos sintetizados por la vía plastídica del MEP. La extrema complejidad de su metabolismo, por un lado, y la ocasionalidad de su biosíntesis tanto a nivel espacial como temporal, por otro, justifican la dificultad de su estudio. Este trabajo pretende ser una introducción al estudio de los genes que codifican para las enzimas (DXS y DXR) que catalizan las dos primeras etapas de la ruta MEP de síntesis de IPP, utilizando para ello Arabidopsis thaliana, modelo universal de la genética molecular vegetal. De acuerdo con estos antecedentes se han planteado los siguientes objetivos que enunciamos a continuación: 1.-Identificar, aislar y caracterizar los genes DXS y DXR de A. thaliana. 2.-Resolver la función de las proteínas DXS y DXR en relación con las dos primeras etapas enzimáticas de la recientemente descubierta ruta MEP de síntesis de IPP. 3.-Analizar el patrón de expresión de los genes DXS y DXR. 4.-Determinar la localización subcelular de las proteínas DXS y DXR. 5.-Generar y examinar plantas transgénicas de sobreexpresión DXS y DXR, con el propósito de obtener información acerca de posible papel regulador en la biosíntesis de los isoprenoides plastídicos. 6.-Introducir el estudio de la interacción entre las vías MEP y del MVA de síntesis de IPP coexistentes en la célula vegetal.
Glucose and white adipose tissue metabolism. Effects of site and sex on the fate of glucose
(Universitat de Barcelona, 2018-02-19) Rotondo, Floriana; Alemany, Marià, 1946-; Romero Romero, María del Mar; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] The current theories about endothelial inflammation in the adipose tissue in metabolic syndrome point to hypoxia as one of its main causes. Nevertheless, our group has found that both 3T3L1 adipocytes, under normoxic conditions, and WAT, in vivo, consume large amount of glucose, with high production of lactate and glycerol irrespective of oxygen availability. This thesis is based on the hypothesis that adipocytes act essentially as glycolytic cells impervious to hypoxia, and their metabolism may help reduce the blood glucose levels. We assumed that hypoxia, could affect the cells of the stromal fraction, eliciting an inflammatory response. To this purpose, we have studied ex vivo the glycolytic and anaerobic capacity of adult adipocytes and stromal vascular cells of both sex and obtained from different WAT sites, developing the methodology needed for a quantitative comparative analysis of data obtained from the same cultured cells well. We found that adipocytes, despite being the cells present in WAT in lower numbers, occupied almost the whole volume of the tissue, a consequence of their huge size due to their inert fat vacuole. The overall “live cell" volume represented only about 1.5% of the tissue, thus showing a very high metabolic activity of WAT in relative terms. Adipocytes ex vivo incubated with glucose, also took large amounts of the sugar, irrespective of its concentration, releasing instead 3C metabolites, such as lactate and glycerol to the medium. Lactate was fully derived from glucose and was produced at a steady pace, irrespective the presence of oxygen, to form the ATP needed for cell functions. Glycerol efflux increased over time and its origin shifted from glycolitic to glycolytic-lipolytic: new-formed glycerol was incorporated into TAG, by esterification with acyl-CoA, derived from the same TAG lipolisis. The coexistence of these processes appears as a “futile cycle”, with the probable function further to waste excess energy. Lipogenesis was limited because the size of cells limits the access to oxidative mitochondrial pathways. The release of 3C metabolites seems to be a mechanism to lower glycemia, defend WAT against excess of substrate, and provide 3C fragments as more accessible substrates for other tissues. Mesenteric WAT adipocytes presented the highest metabolic activity, probably to help the hepatic handling of NEFA and reduce the flow of intestinal glucose to the liver. While in almost all WAT sites, excess mitochondrial pyruvate is returned to the cytoplasm to keep forming lactate; in female mesenteric adipocytes it is in part oxidized to acetyl-CoA to fuel lipogenesis. Stromal vascular cells also released lactate, even more than adipocytes per unit of tissue weight, but not glycerol nor NEFA. Red blood cells produced lactate, but its contribution was quantitatively minimal. Thus, stromal cells, acted in consonance with adipocytes, in all sites and sexes examined, wasting glucose in an anaerobic way, producing high amounts of 3C units. Thus, reinforcing the idea that WAT may be an active protagonist both in energy handling and in the body control of glycemia.
La proteína DOR/TP53INP2 modula negativamente la mitofagia dependiente de Parkin
(Universitat de Barcelona, 2017-09-22) Enciso Salas, Hilda Yuliana; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[spa] TP53INP2 es una proteína nuclear que activa la autofagia en moscas y células eucariotas. El propósito de esta tesis doctoral fue investigar si TP53INP2 modula la autofagia mitocondrial dependiente de Parkin. Aquí, se demuestra que en un modelo de sobreexpresión de TP53INP2 se reduce la actividad mitofágica en respuesta al agente despolarizante CCCP o a los inhibidores de la cadena respiratoria Oligomicina/Antimicina A, en células que expresan Parkin. Además, este modelo causa modificaciones en el metabolismo mitocondrial. Así por ejemplo, la sobreexpresión de TP53INP2 produjo un incremento de la masa mitocondrial y una mayor susceptibilidad frente al estrés oxidativo mientras que la pérdida de función de TP53INP2 causó una reducción de la masa mitocondrial y del potencial de membrana mitocondrial. Asimismo, se pudo determinar que no hay cambios en la expresión de reguladores de la biogénesis mitocondrial (PGC-1α), esto sin duda refuerza la hipótesis de que el efecto de TP53INP2 sobre el metabolismo mitocondrial es debido a cambios en la mitofagia. Posteriormente, con el propósito de analizar los mecanismos por los cuales TP53INP2 disminuye la mitofagia dependiente de Parkin, se analizó la localización celular de la proteína. Sorprendentemente, se observó que ciertos estresores mitocondriales causan el reclutamiento de TP53INP2 a la mitocondria y este efecto es acelerado por Parkin. Prosiguiendo estos resultados en células que expresan Parkin, se descubrió que TP53INP2 inhibe la acumulación de PINK1 en condiciones en las cuales la membrana mitocondrial se encuentra despolarizada. Al mismo tiempo, se encontró una reducción en la estimulación de la fosforilación de la ubiquitina en el residuo S65. Por otra parte, se determinó que TP53INP2 colocaliza con Parkin en el núcleo en condiciones basales o en condiciones de daño mitocondrial. Esta aparente interacción no requiere PINK1 dado que células deficientes en esta proteína también mostraron una colocalización positiva en ambas situaciones. De igual forma, TP53INP2 interactúa físicamente con Parkin, esta interacción es mantenida con una forma corta de Parkin que carece del dominio UBL, la cual a diferencia de la forma larga no colocaliza con la mitocondria en condiciones de despolarización de la membrana mitocondrial. Sin embargo, la interacción fue abolida por una forma mutante de Parkin que carece de la actividad ubiquitina ligasa. En suma, en esta tesis se demuestra que TP53INP2 participa en el mantenimiento de la función e integridad mitocondrial a través de un mecanismo que implica la inhibición de PINK1 en la mitocondria dañada y por consiguiente la disminución de la mitofagia a través de la vía PINK1/Parkin. Los resultados de esta tesis indican que TP53INP2 representa una especie de interruptor que activa la autofagia general o no selectiva pero previene un tipo de autofagia selectiva, la mitofagia dependiente de PINK1/Parkin, en células de mamífero.
Heteroligomeric interactions of the Kv1.3 channelosome
(Universitat de Barcelona, 2017-05-05) Roig Merino, Sara Raquel; Felipe Campo, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] Voltage-gated potassium channels are proteins that allow the flux of potassium ions across the plasma membrane in response to a voltage stimulus. Those proteins were initially described in nervous system as the repolarization entities posterior to a depolarization. However, several different roles have been discovered to be enhanced, mediated or influenced by those entities. Cell cycle progression, homeostasis, proliferation or activation and apoptosis program are some of those functions. Kv1.3 is the third member of the first family of voltage-gated potassium channels in humans. This specific entity is mainly expressed in nervous and immune system. It has been associated with the repolarization of neurons, the activation and proliferation of leukocytes and apoptosis. Moreover, its dysfunctionality has been related to some autoimmune disease. The fine-tunning of the channel is highly relevant to control the final cell decision. The subunits that accompany the channel were classically named as β- subunits. Several different families have been described to modulate some channel features. Kvβ family are cytoplasmic proteins that can enhance the traffic to the plasma membrane and promote a switch towards negative voltages of the channel activation. However, few are known about alternative locations and Kv1.3 modulation. KCNE family are single spanning proteins highly promiscuous that modulate several different Kvα-subunits. Depending on the KCNE subtype, the effect on the channels can present different natures. This dissertation is focused on KCNE4 member, a peptide which generally negatively regulates Kv channels. This thesis described the positioning of Kvβ2.1, but not Kvβ1.1, in specific regions of the plasma membrane: lipid raft microdomains. Those are considered as signalling platforms at the plasma membrane highly relevant for several cellular processes. The possible mechanism that drives Kvβ2.1 is the palmitoylation of its amino acidic sequence; even other causes are not discarded. Proliferation signals are enhancing this localization while PMA treatment generates the opposite effect. This protein, as well as its partner Kvβ1.1, can form homo and heteroligomers. Their affinity and stoichiometry was addressed. Furthermore, multiprotein complexes were detected at membrane associated environments. Traffic and electrophysiological consequences on the channel were analysed upon coexpression with those subunits. Kv1.3 was removed from lipid raft microdomains and Kvβs prevented partially its PMA-dependent internalization. The molecular determinants involved in the Kv1.3 traffic to the plasma membrane were localised at the C-terminal domain. Previous results from the laboratory determined that KCNE4 is impairing the traffic of the channel. This thesis deciphered the molecular mechanisms involved in this effect concluding a bipartite system: (i) the masking of Kv1.3 export signal and (ii) the transference of a retention signal to the channelosome. Moreover, the specific domains of Kv1.3 and KCNE4 implicated in their interaction were mapped and pointed out to the C-terminal regions of both peptides. KCNE4 was also found to form oligomers and present several signals for its retention at the endoplasmic reticulum. Finally, the combination of both subunits (Kvβ2.1 and KCNE4) on the channel showed a dominance of KCNE4 effects, but an electrophysiological function of Kvβ2.1 on Kv1.3 kept preserved. Thus, the present thesis brought light to the comprehension of Kv1.3 channelosome.
Role of DOR/TP53INP2 in the control of muscle protein degradation = Papel de DOR/TP53INP2 en el control de la degradación de proteínas en el músculo esquelético
(Universitat de Barcelona, 2016-12-01) Martínez Cristóbal, Paula; Zorzano Olarte, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] Protein homeostasis (proteostasis) results from the fine regulation of synthesis and degradation. The nuclear cofactor DOR/TP53INP2 was identified originally as a protein expressed in PML of nuclear bodies. However, in response to cellular stress, DOR/TP53INP2 exits the nucleus, localizes to early autophagosomes and regulates autophagy. Recent data from our laboratory has demonstrated that DOR promotes muscle wasting by the activation of basal autophagy in skeletal muscle. Aim of this project is to analyze the role of DOR/TP53INP2 in combining the regulation of autophagy with other muscle homeostatic processes like the Ubiquitin- Proteasome System. Our results indicate that DOR is a negative regulator of the proteasome activity in C2C12 cells and skeletal muscle. Our data suggest that this upregulation of the proteasome activity in DOR-deficient cells is modulated by an induction of some subunits of the proteasome such as PSMD4 and PSMD11, subunits of the 19S regulatory particle involved in the recognition of Ub and proteasome assembly. Moreover, results suggest that DOR is also a negative regulator of protein synthesis. The comprehension of DOR function in regulating proteostasis will potentially identify new targets against muscle atrophy. Indeed, DOR expression is repressed in wasting conditions such as diabetes and cancer cachexia.
Functional role of pentose phosphate pathway and glutamine in cancer cell metabolism
(Universitat de Barcelona, 2016-11-04) Polat, Ibrahim H.; Cascante i Serratosa, Marta; Sabatier, Philippe; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] In this thesis, tumor metabolic reprogramming has been exploited in order to propose new targets in cancer treatment. On one hand, we explored the pentose phosphate pathway (PPP) enzymes as putative therapeutic targets against breast and colon cancer. We observed that inhibition of ox-PPP enzymes G6PD in colon cancer cells and 6PGD in breast cancer cells halted cell prolifertion, resulted in cell cycle arrest and apoptosis. We also demosntrated that in colon cancer cells G6PD is strongly regulated by the glutamine availability mediated by NRF2 transcription factor. Moreover, 6PGD inhibition decreased mammosphere formation capacity of breast cancer cells implying that stem cell characteristics of breast cancer cells were altered by 6PGD inhibition. Besides that, 6PGD inhibition also altered the central carbon metabolism of breast cancer cells leading to decreased glucose consumption and increased glutamine consumption. Observing that both pathways are deeply related to glutamine metabolism, we decided to investigate the metabolic network adaptations that breast cancer cells undergo when the glutamine is scarce. Knowing that hypoxic conditions are common features of tumor microenvironments, we also investigated the characterization of a hypoxia mimicking condition which leads to defective mitochondria. In fact, in these two conditions, we produced huge amount of transcriptomics, metabolomics and fluxomics data in order to produce a genome scale metabolic model (GSMM) combining multi-omics data in the frame of a European project which helps us to understand the regulation of metabolic alterations in breast cancer cells. While produced data is to be used in production of GSMM, we also took advantage of the data to study the metabolic adaptations that breast cancer cells undergo in the deprivation of glutamine or when mitochondria are defected. We propose that increased pyruvate cycle with glutamine deprivation and increased reductive carboxylation with not fully functional mitochondria could be targeted in combination therapies to fight against cancer. All in all, besides showing the importance of metabolism in cancer cell proliferation and survival, the results presented in this study also highlights the importance of Systems Biology approaches to understand the molecular mechanisms underlying complex multifactorial diseases in order to develop new potential therapeutic targets.
4F2hc/LAT1 heterodimer: a promising candidate for solving the first atomic structure of a heteromeric amino acid transporter = Heterodímero 4F2hc/LAT1: un candidato prometedor para resolver la primera estructura atómica de un transportador heteromérico de aminoácidos
(Universitat de Barcelona, 2016-05-19) Obando Martínez, Ana Zuleima; Palacín Prieto, Manuel; Rosell Febres, Albert; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] Heteromeric amino acid transporters (HATs) are the unique solute transporters known to be composed of two subunits linked by a disulphide bridge. The heavy subunit (4F2hc or rBAT), a type II membrane N-glycoprotein that traffics HATs to the plasma membrane, and a light subunit, a polytopic membrane protein of the L-Amino acid transporters family (LATs), that is the catalytic subunit. HATs are involved in several physiological processes to sustain life, by carrying amino acids to the places in which they are required for cellular growing, metabolism and signaling pathways. For this reason, overexpression of some of these HATs or their dysfunction is related to different diseases, like inherited aminoacidurias, tumor growth, viral infection and cocaine relapse, among other. Thus, structure determination of these HATs would be very valuable to understand the molecular mechanism and function underlying HATs amino acid transport and their related diseases, which could be useful to develop therapeutic drugs. Beside this relevance, there is no a single structure solved of a LAT, and the structural information concerning interactions between heavy and light subunits is very scarce, due to the challenging of expressing at enough yield and stability eukaryotic membrane proteins for structural studies. In the present work, the stability and dispersity in solution of three different vertebrate HATs, whose LATs have been previously found to be the most stable among 24 metazoan LATs, were investigated to find a good candidate for structural studies. We found that vertebrate 4F2hc/LAT1 was the most stable among the three HATs, and that the expression of such heterodimer in Pichia pastoris increased the yield of protein obtained in comparison with insect cells. This heterodimer showed significantly increased stability respect to human 4F2hc/LAT2, whose structural model at low resolution (21 Å) was determined by 3D reconstruction from negatively stained complexes, in our lab. Thus, evidence corroborating that the stability of HATs are directly involved with the stability of the light subunit, and with the stabilizing effect of 4F2hc heavy chain on those LATs, is provided here. 4F2hc/LAT1, and mainly its light subunit (LAT1), showed binding of substrate and of human LAT1 inhibitor, KYT-0353, after being solubilized and purified in DDM detergent plus a derivative of cholesterol (CHS). This suggests that these proteins purified in DDM/CHS from Pichia membranes are active and stable, and that vertebrate 4F2hc/LAT1 would offer a very approximate structural model to human HATs. On the other hand, 4F2hc/LAT1 could be obtained relatively stable and at enough yield when solubilized in an amphipatic polymer, widely used for structural studies of eukaryotic membrane proteins by cryo-EM, amphipol A8-35. Finally, the 3D reconstruction at low resolution of 4F2hc/LAT1 solubilized in A8-35, reported here, indicates that amphipol solubilization increases the structural definition of the 4F2hc/LAT1 respect to the observed in the previous models of human 4F2hc/LAT2 solubilized in detergent and CHS, probably because the elimination of the DDM bound to the transmembrane segments, and also because of the use of a more stable heterodimer. Taken together, these results indicate that 4F2hc/LAT1 is a good candidate for structural studies by cryo-EM, also due to the recent advances for imaging molecules of close molecular weight to 4F2hc/LAT1.
Characterization of endothelial cell metabolism under different microenvironmental challenges: exploring therapeutic implications of targeting glycogen degradation
(Universitat de Barcelona, 2016-07-05) Jayaraman, Anusha; Centelles Serra, Josep Joan; Cascante i Serratosa, Marta; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] Angiogenesis is the formation of blood vessels from the pre-existing ones and is required for distributing nutrients and oxygen to the tissues through the blood flow. This process is important for tumour tissues as well, which recruit the neighbouring blood vessels for their survival and propagation, the process termed as tumour angiogenesis. Endothelial cells are those that line the blood vessels and are the key players in the process of angiogenesis. Many anti-angiogenic therapies based on targeting the pro-angiogenic factors have not shown to be completely effective against the tumour vessels and pose adverse side-effects. Since metabolism is the downstream effect of any type of cellular induction, exploring metabolic reprogramming of endothelial cells during angiogenic induction could provide alternative therapeutic strategies for targeting tumour angiogenesis. VEGF is identified to be one of the most versatile and potent pro-angiogenic factors for its roles in multiple steps of blood vessel formation. Hypoxia has also been found to be a key regulator of angiogenesis and has been identified to induce a higher production of VEGF by the tumour and stromal cells. Thus in this thesis we present our observations upon exploring the metabolic reprogramming of endothelial cells in the presence of different stimulating factors to understand their effects in the central carbon metabolic pathways. 1. In the first part of the study, methodologies like the tracer-based metabolomics and fluxomics have been used to explore the effects of external factors like hypoxia and VEGF on endothelial cell metabolism. The results revealed a major metabolic adaptation induced by hypoxic condition compared to normal oxygen condition and a subtle, but disctint changes induced by VEGF under both normoxia and hypoxia in endothelial cells. VEGF also showed a major metabolic effect in glycogen metabolism of endothelial cells which has not been explored in detail in the past. 2. In the next part of the study the direct effect on metabolic pathways upon growing endothelial cells with tumour cells has been explored for the first time. This preliminary observation was made by growing endothelial cells with tumour cells that possessed distinct metastatic abilities of low and high metastasis. It was observed that endothelial cells grown with low metastatic tumours showed changes in metabolic pathways similar to those changes by VEGF, and the high metastatic tumour showed a completely distinct metabolic change reiterating the metastatic characteristics, compared to the other. This pioneering study has revealed that even the same types of tumours, when distinct only by their invasive and metastatic abilities, can cause different metabolic adaptations in their neighbouring cells, especially revealing the changes in endothelial cells. 3. In addition to the above observations we found that glycogen metabolism is active in endothelial cells and targeting the glycogen degradation reduced endothelial cell viability and functions related to angiogenesis in the in vitro and in vivo studies, which showed that targeting glycogen metabolism can be an alternative strategy against tumour angiogenesis. 4. A general characterization of glycogen metabolism in endothelial cells was performed to understand this pathway in detail. This part of the study has revealed the characteristics of the key enzymes related to glycogen metabolism and the changes in their activities following environmental perturbations like differing glucose and oxygen contents. The glycogen metabolism in endothelial cells has not been explored before and this study emphasizes the importance of regulating the environmental factors when this metabolic pathway is considered as a target for anti-angiogenesis. Thus these observations provide us clues on exploring metabolic targets as alternative anti-cancer therapies by affecting endothelial cell viability and function, which in turn will affect the angiogenic process.
Kv1.3 and Kv1.5 channels in leukocytes
(Universitat de Barcelona, 2016-04-15) Vallejo Gracia, Albert; Felipe Campo, Antonio; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
[eng] Voltage dependent potassium channels are a group of plasma membrane ion channels with a key role in the immune system as the predominant ion channels controlling the resting membrane potential and tuning intracellular Ca2+ signaling in lymphocytes, monocytes, macrophages, and dendritic cells. Leukocytes present a limited Kv repertoire, including Kv1.3 and Kv1.5 channel isoforms. Kv1.3 is expressed in the immune system, and the blockade of this channel is associated with selective inhibition of T cell activation and proliferation. A functional Kv channel is an oligomeric complex composed of pore-forming and ancillary subunits. The KCNE gene family (KCNE1-5) is a novel group of modulatory Kv channel elements expressed in several tissues including leukocytes. KCNE peptides are small single spanning membrane proteins known to modulate Kv channels trafficking and biophysical properties. The hypothesis of the present PhD thesis entitled “Kv1.3 and Kv1.5 channels in leukocytes” was that changes in the channelosome composition by modulating the heterooligomeric combinations of the Kv1.3 channelosome control physiological and neoplastic cell growth as well as leukocyte responses. Evidence suggests that Kv channels are involved in cell differentiation and cell cycle control (because non-specific drugs, such as 4-AP and TEA, impaire proliferation), and they are also known to be remodeled during carcinogenesis. Thus, we elucidated the role of Kv1.3 and Kv1.5 channels in cell growth and their relationship with cancer, in models such as B lymphocytes and lymphomas (non-Hodgkin lymphomas), pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and glioblastomas. In spite of its significance, the mechanisms that regulate Kv1.3 and its role in the T cell activation are not well known. To that end, we analyzed the expression of KCNEs ancillary subunits upon different states of activation and proliferation of leukocytes (macrophages, T and B lymphocytes). In addition, recent data from our laboratory demonstrate that KCNE4, acting as a dominant negative ancillary subunit, physically interacts with Kv1.3 inhibiting K+ currents and retaining the channel intracellularly. Therefore, we studied the Kv1.3 modulation by the auxiliary subunit KCNE4 in leukocytes.
Estudio de los mecanismos terapéuticos en la inducción de tolerancia inmunológica en un modelo animal de esclerosis múltiple
(Universitat de Barcelona, 2016-02-10) Gómez Morago, Alba; Barquinero, Jordi; Espejo Ruiz, Carmen; Stratmann, Thomas; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
La terapia génica puede ser una herramienta para inducir tolerancia inmunológica de forma experimental. Nuestro trabajo anterior mostró que la transferencia de células de médula ósea que habían sido transducidas con un autoantígeno (MOG40-55) en ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) mejoró el pronóstico de los animales. En este trabajo, hemos tratado de identificar la subpoblación de células de médula ósea transducidas que fue la principal responsable del efecto terapéutico observado. Se encontró que en los cultivos de transducción de células de médula ósea se generaban células mieloides supresoras de los dos subtipos descritos, tanto granulocíticos (CD11b+ Gr-1high) como monocíticos (CD11b+ Gr-1low), y que las células transducidas con mayor eficacia consistieron en gran medida de estos tipos de células. Tanto las células de médula ósea como las dos subpoblaciones de células mieloides supresoras presentaron una capacidad de inhibir la proliferación de células T inducidas por un antígeno in vitro. Curiosamente, a pesar de la constatación de que células CD11b+ Gr-1low transducidas fueron inmunosupresora in vitro y tenían actividades de la arginasa y de la óxido nítrico sintasa, sólo la subpoblación de células CD11b+ Gr-1high transducidas con el antígeno tenía un efecto terapéutico en ratones con EAE establecida. Por último, se observó un mayor porcentaje de células T reguladoras en los bazos de ratones tratados con la población de médula ósea total transducida con MOG y las células CD11b+ Gr-1high lo que sugiere un papel para las células T reguladoras en la mediación del efecto terapéutico.
La transferència de coneixement en el sector biotecnològic: un model alternatiu pel desenvolupament socioeconòmic
(Universitat de Barcelona, 2016-02-09) Valle Álvaro, Elisabet del; Testar, Xavier; Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)
Els baixos resultats obtinguts en els indicadors de transferència de tecnologia des de les universitats i centres públics de recerca a empreses a Catalunya indiquen que aquesta no és una tasca fàcil. Tot i que hi la qualitat de les publicacions científiques dels investigadors que treballen a Catalunya els indicadors relacionats amb patents, que són uns bons estimadors de la capacitat potencial de transferència donada la seva relació amb l'aplicabilitat industrial, no són gaire exitosos. l encara ho són menys els indicadors relatius a la transferència efectiva d'aquests resultats, com les llicències de patents i el nombre de spin-off creades. I, si s'analitzen les tecnologies que s'han transferit es veu que la majoria compleixen una sèrie de requisits: tenen mercat, són rendibles econòmicament des d'un punt de vista de la inversió feta per l'empresa, les tecnologies són viable industrialment i la majoria estan ben protegides legalment davant la possible competència, en especial mitjançant patents. Què passa però passa si hi ha una necessitat que la tecnologia pot satisfer de manera efectiva però que, malgrat poder generar un cert retorn econòmic, no és suficientment rendible econòmicament per l'empresa que la podria portar al mercat? Quines probabilitats hi ha que aquesta tecnologia, potencialment útil per cobrir una necessitat de la societat, arribi realment a ser un producte? Les probabilitats són baixes, a menys que es pugui aconseguir algun tipus de mecenatge o finançament públic que permeti valoritzar la tecnologia i impulsar l'arribada efectiva del producte al mercat. Per altra part, la ciència ha demostrat tenir un gran potencial per ajudar a països en vies de desenvolupament, però són pocs els recursos que s'hi destinen. La biotecnologia és una disciplina que cada vegada té més importància en el camp de la medicina, les tecnologies alimentàries, l'energia i el medi ambient, entre altres. No obstant moltes de les aplicacions de la biotecnologia han estat pensades i dirigides a cobrir principalment les necessitats dels països desenvolupats, on la possibilitat de retorn econòmic és més alta. Així doncs, la biotecnologia representa una de les branques del coneixement que, tot i tenir un demostrat potencial com a eina per millorar el desenvolupament socioeconòmic, actualment gairebé tota la seva transferència està dirigida a la millora de la competitivitat d'economies ja consolidades, és a dir de les societats econòmicament i industrial més desenvolupades. Aquesta tesi pretén endinsar-se en dues problemàtiques: per una banda la transferència de tecnologies no rendibles des d'un punt de vista econòmic i per l'altra, la dificultat d'accés a la biotecnologia que tenen els països en vies de desenvolupament. El seu objectiu és estudiar i dissenyar un model alternatiu de transferència de coneixement, que permeti que les universitats puguin millorar els seus indicadors de transferència redirigint la transferència de tecnologies no rendibles econòmicament per a les empreses de països econòmicament desenvolupats, a empreses de països en vies de desenvolupament, contribuint a més així a la millora de la situació socioeconòmica d’aquests països. D’aquesta forma, es vol afavorir que resultats de recerca amb potencial d’impacte social no es quedin al laboratori, pel fet de no ser rendibles econòmicament per les empreses dels països desenvolupats, i es transformin en productes que donin resposta a necessitats concretes de països en desenvolupament.

Examinar

Enviaments recents