Anàlegs d'oligonucleòtids que incorporen grups tioèter i/o imidazole: reacció amb transplatí i entrecreuament amb la cadena complementària

Abstract

[cat] S'ha desenvolupat una nova metodologia que permet unir covalentment l'oligonucleòtid antisentit i el seu mRNA diana mitjançant la formació d'entrecreuaments amb unitats de trans-Pt(NH3)2. En primer lloc, s'han sintetitzat dos derivats fosforamidit de nucleòsid amb grups imidazole i tioèter units a la nucleobase, respectivament, que permeten incorporar aquestes modificacions en oligonucleòtids seguint la metodologia estàndard del fosfit triester. La introducció d'aquests nous grups funcionals a l'extrem 5' no afecta substancialment l'estabilitat del dúplex amb la cadena complementària. S'han portat a terme assajos de platinació d'oligonucleòtids modificats de mida petita amb l'objectiu d'avaluar la capacitat dels nous grups funcionals de coordinar-se a l'ió metàl·lic, així com amb oligonucleòtids de seqüència mixta amb una o dues modificacions a l'extrem 5'. A partir dels resultats obtinguts s'han dissenyat dues estratègies d'entrecreuament: mitjançant hibridació de l'adducte intracadena oligonucleòtid modificat-transplatí a la cadena complementària, o bé partint del dúplex oligonucleòtid antisentit/cadena complementària i afegint transplatí. En ambdós casos s'ha obtingut el mateix adducte intercadena. La caracterització de tots els adductes platinats s'ha portat a terme per oxidació amb H2O2 i digestió enzimàtica, i posterior anàlisi per espectrometria de masses MALDI-TOF. Dels experiments realitzats s'ha conclòs que la millor combinació suposa la introducció del nucleòsid amb el grup imidazole a l'extrem 5' de l'oligonucleòtid antisentit, seguit del nucleòsid amb el grup tioèter. En la reacció amb transplatí es forma ràpidament i regioselectiva un adducte intracadena, en el qual el platí coordina un nitrogen imidazòlic i el sofre del tioèter. La reacció d'entrecreuament té lloc de manera que l'ió metàl·lic migra del sofre al nitrogen 7 d'una guanina situada enfront dels nucleòsids modificats, mantenint-se inalterada la unió al nitrogen imidazòlic de la cadena antisentit. La presència d'una unitat trans-Pt(NH3)2 entrecreuant ambdues cadenes comporta un gran augment de l'estabilitat tèrmica del dúplex. Finalment, s'ha demostrat que la reacció d'entrecreuament només té lloc quan existeix reconeixement entre l'oligonucleòtid modificat i la cadena complementària, resultat rellevant per a una possible aplicació d'aquesta metodologia en el camp de la teràpia antisentit on la diana tant pot ser el mRNA com els miRNAs.

[eng] New methodology to allow a covalent union between an antisense oligonucleotide and the mRNA target has been developed. The crosslink is established through a trans-Pt(NH3)2 unit. First of all, two phosphoramidite nucleoside analogs with imidazole and thioether groups linked to the nucleobase, respectively, were synthesized. These derivatives allow the introduction of such modifications in oligonucleotides using standard phosphite triester methodology. The introduction of such modifications at the 5' end does not affect substantially the stability of the duplex with the complementary chain. Oligonucleotide platination assays have been carried out, first with small modified model chains to evaluate the ligand capability of the new functional groups, and then with mixed sequences containing either one or the two modifications at the 5' end. On the basis of the results obtained, two crosslinking strategies have been designed: hybridization of the modified oligonucleotide-transplatin intrachain adduct to the complementary chain, and mixing the antisense oligonucleotide, the complementary chain and transplatin. In the two cases, the same interchain adduct was obtained. All platinated adducts have been characterized by oxidation with H2O2 and enzymatic digestion, as well as MALDI-TOF mass spectrometric analysis. The conclusion from these experiments is that best results are obtained when imidazole-modified nucleoside is placed at the 5' end of the antisense oligonucleotide, next to the thioether-derivatized nucleoside. The reaction with transplatin gives quickly and regioselectively an intrachain adduct in which platinum coordinates one nitrogen of the imidazole ring and the sulfur of the thioether. The crosslinking reaction involves a rearrangement that takes the metal ion from sulfur to the nitrogen 7 of the guanine opposite the modified nucleosides, keeping unaltered the union to the imidazole nitrogen of the antisense chain. The presence of the trans-Pt(NH3)2 moiety crosslinking the two chains notably increases the thermal stability of the duplex. Finally, it has been demonstrated that crosslinking reactions only take place when there is molecular recognition between the antisense oligonucleotide and the complementary chain, which is highly relevant for the possible antisense application of this methodology for targeting either mRNA or miRNAs.