Establiment de metodologia analítica per a la purificació, separació i caracterització de biomarcadors proteics de malalties neurodegeneratives

Abstract

[cat]En aquesta tesi doctoral, s’ha desenvolupat metodologia analítica per a la purificació, separació i caracterització de prió cel•lular (PrPC) i superòxid dismutasa (SOD-1), dues proteïnes relacionades amb les Encefalopaties Espongiformes Transmissibles (TSEs) i l’Esclerosi Lateral Amiotròfica (ALS), respectivament. Les TSEs es caracteritzen per l’acumulació de la forma patològica del PrPC (PrPSc) al cervell dels animals afectats, mentre que a l’ALS s’observa la formació d’agregats de SOD-1. Avui dia, encara es desconeixen els factors que inicien i regulen les interaccions que condueixen a la formació d’agregats proteics en moltes malalties neurodegeneratives. Alguns autors suggereixen mecanismes basats en els canvis estructurals que s’observen entre la proteïna nativa i la patològica, que estan relacionats amb la conformació, la seqüència d’aminoàcids, els metalls o les modificacions post-transduccionals. En proteïnes oligomèriques com la SOD-1, també s’ha considerat la dissociació dels oligòmers fins a monòmers abans de l’agregació. És doncs necessari millorar el coneixement de l’estructura d’aquestes proteïnes i aprofundir en els mecanismes que governen l’agregació. En aquest treball es proposa una estratègia de purificació per recuperar de manera eficient PrPC de cervell boví emprant mètodes de purificació convencionals no immuniquímics i western blot (WB) per detectar la presència PrPC en les diferents etapes. Tot seguit s’estudia exhaustivament la separació i caracterització de la SOD-1 mitjançant electroforesi capil•lar acoblada a l’espectrometria de masses amb analitzadors de trampa iònica i de temps de vol (CE-IT-MS i CE-TOF-MS), espectrometria de masses amb font d’ionització per desorció amb làser assistida per una matriu i analitzador de temps de vol (MALDI-TOF-MS) i espectrometria de masses de mobilitat iònica amb font d’ionització per nano-electrosprai (n-ESI-IM-MS). Els estudis amb SOD-1 purificada a partir de mostres de sang d’individus sans i pacients amb ALS han permès obtenir algunes conclusions preliminars interessants sobre els canvis estructurals en la proteïna associats a la malaltia.

[eng] In this thesis, we developed an analytical method for the purification, separation and characterization of cellular prion (PrPC) and superoxide dismutase (SOD-1), two proteins related to Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) and the Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), respectively. The TSEs are characterized by the accumulation of the pathological form of PrPC (PrPSc) in the brain of affected animals, whereas in ALS it is observed the formation of aggregates of SOD-1. Today, factors that initiate and regulate the interactions that lead to the formation of protein aggregates in many neurodegenerative diseases are still unknown. Some authors suggest mechanisms based on the structural changes observed between the native and the pathology protein which cold be related with the conformation, the amino acid sequence, metals or post-translational modifications. In oligomeric proteins such as SOD-1, the dissociation of oligomers to monomers before aggregation it is also considered. So, it is crucial to increase the knowledge of the structure of these proteins and the mechanisms that govern its aggregation for understanding the disease development. This paper proposes a strategy for having an efficient recovery in the purification of bovine brain PrPC using conventional purification methods that not involves immunochemical procedures. The presence of PrPC was checked at different stages by western blot (WB). Then, the separation and characterization of the SOD-1 by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry with ion trap and time of flight analyzers (CE-IT-MS and CE-TOF-MS), matrix-assisted laser desorption/ionization with a time of flight mass analyzer (MALDI-TOF-MS) and ion mobility mass spectrometry with power nano-electrospray ionization source (n-ESI-IM-MS) was studied. The comparison of purified SOD-1 from blood samples of healthy individuals and patients with ALS have yielded some preliminary interesting conclusions about structural changes in the protein associated with cold be related with the disease.