Carregant...
Fitxers
Tipus de document
TesiVersió
Versió publicadaData de publicació
Tots els drets reservats
Si us plau utilitzeu sempre aquest identificador per citar o enllaçar aquest document: https://hdl.handle.net/2445/98260
Correction of point mutations at the endogenous locus of the mammalian dihydrofolate reductase gene using polypurine reverse hoogsteen hairpins
Títol de la revista
Autors
Director/Tutor
ISSN de la revista
Títol del volum
Recurs relacionat
Resum
[cat] Aquest treball es centra en l'estudi de pinces de polipurines "polypurine reverse Hoogsteen (PPRH)", i la seva capacitat com eina en la correcció de gens. La reparació d'una mutació puntual en el seu locus endogen ha sigut el principal tema de molts investigadors en les últimes dècades, utilitzant diverses estratègies com per exemple la teràpia de substitució de gens (GAT) i diferents oligonucleòtids de reparació. La fibrosi quística, anèmia de cèl.lules falciformes i la malaltia de Tay-Sachs son alguns exemples de la gran quantitat de trastorns causats per una mutació puntual. En aquest treball, presentem una metodologia de reparació alternativa que utilitza molècules PPRH, desenvolupades en el nostre laboratori inicialment com a eina de silenciament gènic, amb la hipòtesi que també es podrien aplicar com a eina de correcció de gens. Els PPRH son unes molècules d'ADN de doble cadena, formades per dos dominis de homopurines antiparal•eles, connectades per un bucle de 5 timidines, que formen enllaços de Hoogsteen reversos i intramoleculars. Els PPRHs s'han descrit per unir-se eficaçment a la doble cadena d'ADN formant una estructura de tríplex, i han sigut dissenyats tant contra la cadena motlle com contra la cadena codificant de l'ADN. Tenint en compte la capacitat dels PPRHs per formar una estructura de tríplex amb la cadena de pirimidines de l'ADN, en l'estudi presentat aquí volíem explorar la capacitat dels PPRHs per corregir mutacions puntuals. En primer lloc, es van estudiar les condicions in vitro en les que els PPRHs s'unien a la doble cadena de l'ADN i la mantenien oberta, mitjançant assajos d'unió. Tot seguit, hem dissenyat diferents PPRHs reparadors, tot afegint, al nucli del PPRH, una cua reparadora, complementaria a la regió mutada de l'ADN excepte pel nucleòtid que ha de ser corregit. Aquests PPRHs reparadors s'han utilitzat en cèl.lules de mamífer per reparar una mutació puntual en un plàsmid de la dihydrofolate reductasa (dhfr). Per últim, els resultats positius ens van portar a estudiar la capacitat dels PPRHs reparadors per reparar diferents línies cel.lulars que contenien diferents tipus de mutacions puntuals en el gen endogen de la dhfr. A més, també hem desenvolupat un PPRH millorat, anomenat LDR-PPRH, per "Long-Distance-Repair-PPRH", per reparar mutacions puntuals molt distants respecte la seqüència diana del nucli del PPRH. Tenint en compte la possible alta proporció de guanines en una seqüència de PPRH, es va dur a terme una caracterització in vitro d'aquestes molècules per estudiar l'efecte de les guanines en la formació d'estructures secundàries, com per exemple els G-quàdruplex. També es va estudiar la conformació de triple hèlix formada pels PPRH reparadors amb les seves seqüències diana de pirimidines, fins i tot quan el PPRH reparador es plega en una estructura de G-quàdruplex enlloc de en forma de pinça. Com a segona part de la tesi, hem desenvolupat una nova aplicació de la tècnica d'assaig de canvi de mobilitat electroforètica (EMSA), per demostrar la unció entre els miRNAs i les seves seqüències diana. Durant més de dues dècades, la investigació en el nostre laboratori s'ha centrat en l'estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en la quimioteràpia contra el càncer, per la inhibició del gen de la dhfr. A més de l'amplificació gènica, el nostre grup ha demostrat que molts gens estan involucrats en el mecanisme, així com també hi estan involucrats els micro-RNAs. El miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 van ser identificats per jugar un paper important en la resistència al MTX en cèl.lules de càncer de colon. Per aquesta raó, el miR-224 va ser l'escollit per mostrar d'una manera directa i específica, la seva habilitat per unir-se al gen diana SLC4A4, establint així la tècnica d'EMSA com un mètode senzill i útil per validar la interacció entre un miRNA i la seva diana específica de mRNA.
Descripció
Matèries
Matèries (anglès)
Citació
Citació
SOLÉ FERRÉ, Anna. Correction of point mutations at the endogenous locus of the mammalian dihydrofolate reductase gene using polypurine reverse hoogsteen hairpins. [consulta: 11 de desembre de 2025]. [Disponible a: https://hdl.handle.net/2445/98260]