Desarrollo de modelos celulares para estudios terapéuticos en la enfermedad de Alzheimer

Abstract

[spa] La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia neurodegenerativa en los países desarrollados y su prevalencia aumenta con la edad. Los genes cuyas mutaciones son responsables de EA familiar son APP, PSEN1 y PSEN2, las mutaciones en PSEN1 siendo las más frecuentes. La mayoría de los casos son de EA esporádica y la edad es el principal factor de riesgo. Los mecanismos implicados en el envejecimiento del cerebro que contribuyen a la aparición de la EA aún no se han desentrañado, pero probablemente incluyen la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo y la inflamación cerebral. Los modelos experimentales de cultivos celulares han demostrado su eficacia para reproducir aspectos patológicos de la EA y facilitar el estudio de posibles terapias. Los objetivos son: 1.- Estudiar el estrés oxidativo, las alteraciones mitocondriales y el efecto del tratamiento con suero de restricción calórica en cultivos de astrocitos SAMP8. 2.- Estudiar el estado inflamatorio basal y la respuesta a estímulos proinflamatorios en cultivos de astrocitos y microglía SAMP8 y en el tejido cerebral in vivo de SAMP8. 3.- Desarrollar las bases de un modelo celular que exprese mutaciones en el gen PSEN1 asociadas a la EA monogénica. El estudio de los astrocitos de los ratones de senescencia acelerada SAMP8 mostró estrés oxidativo y alteraciones mitocondriales. El suero de restricción calórica redujo el estrés oxidativo y las alteraciones mitocondriales y protegió contra la senescencia replicativa. Los astrocitos y microglía SAMP8 mostraron un aumento de la inflamación, que se vió agravada por estímulos proinflamatorios, principalmente en microglía. In vivo, LPS potenció la respuesta inflamatoria en el cerebro de ratones SAMP8 de 6 meses de edad pero este efecto se extinguió a los 12 meses. En el diseño de un modelo celular para el estudio de las mutaciones familiares PSEN1, la técnica de mutagénesis dirigida permitió generar los plásmidos con mutaciones de interés clínico p.L286P, p.K239N y p.E120G. La transfección se realizó mediante un plásmido retroviral en células MEF deficiente para los genes de presenilina. Se creó la línea de células con el constructo PSEN1 WT y expresando GFP. Además, se optimizó la infección con varios adenovirus, Ad-APPswe, Ad-APPwt y Ad-β-galactosidasa, para el estudio de cambios patológicos en la generación de péptidos amiloides. En conclusión, los astrocitos y/o microglía SAMP8 presentan mecanismos relacionados con la edad que pueden ser la base de procesos asociados a la EA. En cuanto al estudio de las mutaciones PSEN1, se establecieron las bases para el diseño de un modelo celular apropiado. Los modelos celulares desarrollados son potencialmente útiles para los estudios terapéuticos en EA.

[eng] Alzheimer's disease (AD) is the most common cause of neurodegenerative dementia in developed countries and its prevalence increases with age. The genes whose mutations are responsible for familial AD are APP, PSEN1 and PSEN2, mutations in PSEN1 being the most frequent. Most cases are sporadic AD and age is the main risk factor. The mechanisms involved in brain aging that contribute to the onset of AD have not yet been unraveled, but probably include mitochondrial dysfunction, oxidative stress and brain inflammation. Cell culture experimental models have proven effective to reproduce pathological aspects of AD and facilitating the study of potential therapies. The objectives are: 1. Study oxidative stress, mitochondrial abnormalities and the effect of the treatment with caloric restriction serum in cultured astrocytes SAMP8. 2. Study the baseline inflammatory status and response to proinflammatory stimuli in cultured astrocytes and microglia SAMP8 and brain tissue in vivo SAMP8. 3. Develop the foundations for a cell model that expresses PSEN1 gene mutations associated with monogenic AD. The study of astrocytes of senescence accelerated SAMP8 mice showed oxidative stress and mitochondrial alterations. Caloric restriction serum reduced oxidative stress and mitochondrial alterations and protected against replicative senescence. Astrocytes and microglia SAMP8 showed increased inflammation, which was exacerbated by proinflammatory stimuli, mainly in microglia. In vivo, LPS potentiate the inflammatory response in the brain of 6-month old SAMP8 mice but this effect was extinguished at 12 months. In designing a cellular model for studying PSEN1 familial mutations, directed mutagenesis allowed generate the plasmids with mutations of clinical interest p.L286P, p.K239N and p.E120G. Transfection was performed in MEF PSEN1-/ - cells with a retroviral plasmid. The cell line with the construct PSEN1-WT and expressing GFP was created. Also, the infection with several adenovirus, ad-APPswe, ad-APPwt and ad-β-galactosidase, was optimized for the further study of pathological changes in the generation of amyloid peptides. In conclusion, astrocytes and/or microglia SAMP8 present age-related mechanisms that may underlie processes associated with EA. Regarding the study of PSEN1 mutations, the basis for the design of appropriate cellular model were established. Developed cell models are potentially useful for therapeutic studies in AD.