Nuevas estrategias de condicionamiento miocárdico: Cardioprotección por nutracéuticos en cardiopatía isquémica Pablo Sutelman ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intelꞏlectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author. p Memoria de tesis doctoral presentada por Pablo Sutelman para optar al grado de doctor por la Universitat de Barcelona Directores de Tesis: § Dra. Gemma Vilahur García – Hospital de la Santa Creu i Sant Pau § Prof. Lina Badimon Maestro– Hospital de la Santa Creu i Sant Pau Tutor de Tesis: § Dr. Josep M. Canals Coll – Hospital Clinic Barcelona Mayo de 2023 Programa de Doctorado Medicina e Investigación Traslacional Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud Universidad de Barcelona 1 5 AGRADECIMIENTOS “Llega a ser quién eres” Píndaro. 475 a.C. Esta tesis doctoral no habría sido posible sin la ayuda de una innumerable cantidad de personas, que han colaborado directa e indirectamente para poder llevarla a su fin. En primer lugar, quisiera agradecer a la Dra. Gemma Vilahur, quien con su notable conocimiento científico y técnico me ha brindado todas las herramientas necesarias para dar forma a este proyecto y muchos otros en el proceso, y ha sido una verdadera mentora con su predisposición, atención al detalle y hasta apoyo anímico cuando las horas de trabajo se hacían largas. A la Dra. Lina Badimon, quien es y ha sido una guía y referente, y me ha dado la posibilidad de desarrollarme en el ámbito de la investigación. Y a la Dra. Teresa Padró, que me abrió las puertas para permitirme embarcar en tamaña empresa. A todos y cada uno de mis colegas del ICCC, que me han acompañado en gran parte de este camino, compartiendo comidas y experimentos y haciéndolo en el proceso mucho más entretenido. Sin olvidarme por supuesto de los técnicos del laboratorio, que me han ofrecido sus consejos y sabiduría sin esperar nada a cambio y gracias a los cuales sin lugar a dudas esto se ha hecho posible. A mis compañeros y amigos de la Medicina, que me dieron el espacio para dedicarme a la tesis y tomarme el tiempo necesario para trabajar en ella, aún en nuestro día a día que puede ser intenso y demandante. Quisiera agradecer particularmente a mi familia y amigos de toda la vida, quienes cerca o a la distancia me brindaron en todo momento su apoyo y ánimo para cumplir esta meta personal, y siempre estuvieron allí cuando hacía falta. Y sobre todo a la mujer que me acompañó en esta locura y muchas otras, que se ha encargado de mantenerme con vida, alentarme y darme todo para poder llegar a ser quien soy. En gran medida, esta tesis es fruto y parte de cada uno de ellos y por ese motivo les doy mis más sinceros agradecimientos. 6 ÍNDICE 1. ABREVIACIONES .............................................................................................. 9 2. ENUMERACIÓN DE ARTÍCULOS ................................................................... 13 3. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 14 3.1. Epidemiología de la enfermedad cardiovascular ...................................................... 14 3.1.1. Factores de riesgo cardiovascular .......................................................................................... 17 3.2. Fisiopatología de la cardiopatía isquémica ................................................................ 26 3.2.1. Aterosclerosis ............................................................................................................................. 26 3.2.2. Cardiopatía isquémica e infarto agudo de miocardio ......................................................... 32 3.3. Daño por isquemia/reperfusión .................................................................................. 37 3.3.1. Metabolismo energético cardíaco y fenómeno de lipotoxicidad ...................................... 41 3.4. Remodelado ventricular adverso e insuficiencia cardíaca ......................................... 43 3.4.1. Mecanismos moleculares y celulares ..................................................................................... 44 3.4.2. Activación del sistema neuro-humoral ................................................................................... 46 3.5. Estrategias de cardioprotección ................................................................................. 47 3.5.1. Protección miocárdica endógena: condicionamiento isquémico ...................................... 47 3.5.2. Condicionamiento farmacológico .......................................................................................... 51 3.6. Nutracéuticos: potenciales estrategias de cardioprotección .................................... 53 3.6.1. Definición y usos ....................................................................................................................... 53 3.6.2. Nutracéuticos, enfermedad cardiovascular y potencial de cardioprotección ................. 55 3.6.3. Espirulina .................................................................................................................................... 61 3.6.4. Silybum marianum ..................................................................................................................... 62 3.7. Modelo animal de infarto agudo de miocardio ......................................................... 64 3.7.1. Características y potencial traslacional de modelos animales ............................................ 64 3.7.2. Modelo porcino de infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST ......... 65 4. HIPÓTESIS ...................................................................................................... 67 5. OBJETIVOS ..................................................................................................... 68 5.1. Objetivo 1 ..................................................................................................................... 68 5.2. Objetivo 2 ..................................................................................................................... 68 6. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS ........................................................ 70 6.1. Artículo 1 ...................................................................................................................... 71 6.1.1. Material suplementario ............................................................................................................. 85 7 6.2. Artículo 2 ...................................................................................................................... 87 6.2.1. Material suplementario ............................................................................................................. 99 7. DISCUSIÓN ................................................................................................... 105 7.1. Cardioprotección mediante condicionamiento miocárdico .................................... 105 7.2. Nutracéuticos como vehículos terapéuticos ............................................................ 105 7.3. Modulación metabólica de espirulina y Silybum marianum .................................... 106 7.4. Cardioprotección mediante condicionamiento por espirulina y Silybum marianum ............................................................................................................................................ 107 7.5. Perfil de bioseguridad de Espirulina y Silybum marianum ...................................... 113 7.6. Limitaciones ................................................................................................................ 114 8. CONCLUSIONES .......................................................................................... 116 9. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 118 8 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Prevalencia mundial de cardiopatía isquémica ........................................... 14 Figura 2. Causas de mortalidad global ......................................................................... 15 Figura 3. Niveles de prevención poblacional ............................................................... 17 Figura 4. Contribución relativa de factores de riesgo cardiovascular ...................... 20 Figura 5. Esquema de progresión de la enfermedad aterosclerótica ...................... 30 Figura 6. Fisiopatología de la enfermedad aterosclerótica ....................................... 31 Figura 7. Clasificación del infarto agudo de miocardio .............................................. 33 Figura 8. Mecanismos de daño por isquemia/reperfusión ........................................ 40 Figura 9. Metabolismo lipídico cardíaco ...................................................................... 42 Figura 10. Fenotipos y características de la insuficiencia cardíaca según FSVI ...... 44 Figura 11. Fases temporales de aplicación del condicionamiento miocárdico ...... 48 Figura 12. División de nutracéuticos según su origen y procesamiento ................. 54 Figura 13. Mecanismos de acción de espirulina ........................................................ 109 Figura 14. Mecanismos de acción de Silybum marianum ........................................ 113 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Clasificación química y principales propiedades terapéuticas de los nutracéuticos. .................................................................................................................... 55 Tabla 2. Mecanismos moleculares de cardioprotección por nutracéuticos. ........... 58 9 1. ABREVIACIONES ACE Enzima convertidora de angiotensina Acil-CoA Acil-Coenzima A ADMA Dimetilarginina asimétrica ADP Difosfato de adenosina Akt Familia de proteínas quinasas B AMP Monofosfato de adenosina AMPK Protein-quinasa activada por monofosfato de adenosina ApoB Apolipoproteína B ATII Angiotensina II ATP Adenosín trifosfato AVC Accidente vascular cerebral Bax Proteína X asociada a Bcl-2 Bcl-2 Proteína de células B-2 BRCA1 Gen relacionado al cáncer de mama 1 C-HDL Colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad C-LDL Colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad cAMP Monofosfato cíclico de adenosina CaMKII Calcio-calmodulina quinasa II CCL2 Ligando 2 de quimioquina CCR Receptor de quimioquina CD Clúster de diferenciación Cox Ciclooxigenasa CPT Carnitin-palmitoltransferasa CT Colesterol total CV Cardiovascular DAG Diacilglicerol DALY Disability Adjusted Life Years (Años de vida ajustados por discapacidad) DAMP Patrones moleculares de daño celular DAPT Doble antiagregación plaquetaria DASH Dietary Approaches to Stop Hypertension (Enfoques Alimentarios para Detener la Hipertensión) DGAT Diacilglicerol acil-transferasa DM Diabetes mellitus DNA Ácido desoxirribonucleico 10 ECV Enfermedad cardiovascular ERK 1-2 Quinasa regulada por señales extracelulares 1/2 FA Fibrilación auricular FEVI Fracción de eyección del ventrículo izquierdo GLP-1 Péptido simil-glucagon tipo 1 GLUT Transportador de glucosa regulado por insulina GP IIb/IIIa Glicoproteína IIb/IIIa HbA1c Hemoglobina glicada A1c HO-1 Hemo oxigenasa-1 HDL Lipoproteína de alta densidad HIF-1a Factor inducible por hipoxia-1 alfa HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A HTA Hipertensión arterial I/R Isquemia/reperfusión IAM Infarto agudo de miocardio IAMCEST Infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST IC Insuficiencia cardíaca IC 95% Intervalo de confianza 95% ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1 ICP Intervención coronaria percutánea IL Interleuquina IMC Índice de masa corporal JAK-STAT Citoquina Janus quinasa/transductor de señal y activador de transcripción JNK Quinasa c-Jun N-terminal KLF4 Factor 4 simil-Kruppel LDL Lipoproteína de baja densidad LDLac Lipoproteína de baja densidad acetilada LDLag Lipoproteína de baja densidad agregada LDLox Lipoproteína de baja densidad oxidada LPL Lipoproteinlipasa LRP1 Proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad MAPK Proteína quinasa activada por mitógeno MCP-1 Proteína quimioatrayente de monocitos 1 MDR1 Mutación de resistencia a multidrogas 1 MMP Metaloproteinasas de matriz 11 mTOR Diana de rapamicina en células de mamífero NAD Nicotinamida adenina dinucleótido NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NF-kB Factor nuclear kappa de células B activadas NLRP3 Dominio de pirina de la familia NLR 3 NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintetasa NOX Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa Nrf2 Factor nuclear eritroide 2 OMS Organización Mundial de la Salud ORAI 1-3 Modulador de calcio activado por liberación de calcio 1-3 P2Y Receptor purinérgico (purinoceptor) P2Y PAR-1 Receptor de la trombina proteasa-activada tipo 1 PCRE Ecuación de riesgo de cohorte agrupada pH Potencial de hidrógeno PPAR-g Receptor activado por proliferador peroxisomal gamma PYLL Años de vida potencialmente perdidos RAAS Sistema renina-angiotensina-aldosterona RIQ Rango intercuartílico RISK Quinasa de salvamiento por injuria-reperfusión ROS Especies reactivas de oxígeno RR Riesgo relativo SAFE Factor activador de supervivencia SCA Síndrome coronario agudo SCACEST Síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST SCASEST Síndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST SCORE 2 Evaluación sistemática del riesgo coronario 2 SCORE 2-OP Evaluación sistemática del riesgo coronario 2 para personas mayores SERCA Enzima sarco/retículo endoplásmico ATPasa-dependiente de calcio SIRT-1 Sirtuína-1 deacetilasa dependiente de NAD SMAD 2/3 Proteína pequeña derivada de MAD (madres contra la decapentaplejia) 2/3 SNS Sistema nervioso simpático SOD Superóxido dismutasa STIM-1 Molécula de interacción estromal-1 TA Tensión arterial TAD Tensión arterial diastólica 12 TAS Tensión arterial sistólica TET2 Tet Metilcitosina Dioxigenasa 2 TGF-b Factor de crecimiento transformante beta TLR-4 Receptor simil-Toll 4 TNF-a Factor de necrosis tumoral alfa TXA2 Tromboxano A2 VCAM-1 Proteína 1 de adhesión celular vascular VI Ventrículo izquierdo VLDL Lipoproteína de muy baja densidad VLDL-R Receptor de lipoproteína de muy baja densidad VWF Factor de Von Willebrand Con la finalidad de facilitar la lectura de esta tesis doctoral, las abreviaciones de moléculas y compuestos que resultan usualmente conocidas en inglés se han mantenido en dicho idioma, con su correspondiente aclaración en español, para homogeneizarlas respecto a los trabajos originales publicados en inglés incluidos como parte de esta tesis. Por otro lado, las siglas de patologías así como la medición de variables y parámetros que normalmente son utilizadas en español han permanecido en ese idioma para preservar la armonía del texto. 13 2. ENUMERACIÓN DE ARTÍCULOS Esta tesis doctoral ha sido desarrollada en formato de compendio de publicaciones. La tesis consta de dos objetivos y dos artículos publicados bajo revisión por pares. § Artículo 1: Vilahur G*, Sutelman P*, Ben-Aicha S, Mendieta G, Radiké M, Schoch L, Casaní L, Borrell- Pagés M, Padro T, Badimon L. * both authors contributed equally Supplementation With Spirulina Reduces Infarct Size and Ameliorates Cardiac Function in a Pig Model of STEMI. Frontiers in Pharmacology. 2022 May 3; 13: 891801. DOI: 10.3389/fphar.2022.891801. Categoría Journal Citation Report Factor Impacto Farmacología Q1 5.988 § Artículo 2: Vilahur G, Sutelman P, Mendieta G, Ben-Aicha S, Borrell-Pages M, Peña E, Crespo J, Casaní L, Badimon L. Triglyceride-induced cardiac lipotoxicity is mitigated by Silybum marianum. Atherosclerosis. 2021 May; 324: 91-101. DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2021.03.014. Categoría Journal Citation Report Factor Impacto Sistema cardíaco y cardiovascular Q1 6.847 14 3. INTRODUCCIÓN 3.1. Epidemiología de la enfermedad cardiovascular El incremento sustancial de la población mundial observado durante el último siglo ha promovido a nivel epidemiológico un proceso de transición caracterizado por una significativa reducción en la mortalidad por enfermedades comunicables a expensas de un aumento en la incidencia de patologías no comunicables. Dentro de este último grupo, la enfermedad cardiovascular (CV) constituye actualmente la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, representada fundamentalmente por la cardiopatía isquémica y el accidente vascular cerebral (AVC) (1, 2). A nivel europeo, da cuenta del 45% de la tasa de mortalidad total, y se estima que 113 millones de personas conviven con diversos grados de enfermedad cardiovascular (ECV) (2). La Figura 1 ilustra la prevalencia global de cardiopatía isquémica especificada según regiones geográficas. Figura 1. Prevalencia mundial de cardiopatía isquémica. Estandarizada por edad, cada 100.000 personas (Intervalo de confianza 95%). Adaptado de (3). 1237,8 1541,6 1721,3 2649,8 2519,5 2150,9 1470,5 1821,2 1324,9 2518,1 1573,6 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 A M ÉR IC A D EL S U R A M ÉR IC A C EN TR A L A M ÉR IC A D EL N O RT E EU R O PA D EL E ST E EU R O PA O C C ID EN TA L A SI A C EN TR A L SU D ES TE A SI Á TI C O O C E A N ÍA A FR IC A C EN TR A L A FR IC A D EL N O RT E A FR IC A D EL S U R GLOBAL 15 En este contexto, la enfermedad cardíaca de etiología isquémica representa la primera causa de muerte CV. El incremento significativo advertido en su prevalencia se debe, en gran medida, al aumento en la media de edad poblacional derivado de una mayor expectativa de vida (80,8 años en mujeres y 74,8 años en hombres en países desarrollados), y a su vez, al incremento en la aparición de patología crónica asociada, inherente al aumento etario, que contribuye asimismo a incrementar el riesgo CV total. (2, 4). De esta manera, la ECV produce anualmente la muerte de 4 millones de personas en Europa, con una proporción ligeramente mayor en el sexo femenino (55% de mujeres), y superando ampliamente las tasas de mortalidad por cáncer y otras patologías crónicas (Figura 2) (2, 5). Figura 2. Causas de mortalidad global, estratificadas por patología cardiovascular. Modificado de (6). Más aún, su impacto en la población joven resulta incluso más significativo, lo cual queda evidenciado a través de dos indicadores de relevancia: la muerte prematura de origen CV, que refleja una métrica de sobrevida potencial no cumplida, donde la ECV representa un 31% del total; y los años de vida potencialmente perdidos (PYLL por sus siglas en inglés Potential Years of Life Lost), una variable que estima los años de vida que habría vivido una persona de no haber tenido una muerte prematura (en base a la expectativa de vida calculada), alcanzando la patología CV los 37 millones de años perdidos en Europa (un 37,5% del total, comparado al cáncer que produce un 24,5%) (2). No obstante, y contrariamente a estas cifras alarmantes, en las últimas décadas se ha advertido una reducción proporcional tanto en las tasas de mortalidad CV como en su prevalencia total ajustada por edad (7, 8), derivado principalmente por una mejoría en el pronóstico de los pacientes que padecen cardiopatía isquémica, así como una disminución en los casos de muerte súbita extra-hospitalaria (1, 9). 42% 20% 7% 5% 4% 22% Enfermedad cardiovascular Cáncer Enfermedad respiratoria Traumatismos Demencia Otras causas Cardiopatía isquémica: 42% Accidente vascular cerebral: 24% Cardiopatía hipertensiva: 6% Cardiopatía valvular: 2,5% Otras causas cardiovasculares: 27% 42% 20% 7% 5% 4% 22% Enfermedad cardiovascular Cáncer Enfermedad respiratoria Traumatismos Demencia Otras causas 16 Igualmente, se observa una importante variabilidad en el manejo de la ECV entre distintas zonas geográficas, siendo un 30% mayor su impacto en personas provenientes de países de ingreso medio en comparación a aquellos de altos ingresos (10). Esto queda expresado en los años de vida ajustados por discapacidad (DALYs de Disability Adjusted Life Years), un parámetro que brinda información combinada de muerte prematura y discapacidad, y que resulta hasta 4 veces más alto en los países menos ricos (2). El principal objetivo terapéutico en el abordaje de la ECV se centra en una adecuada implementación de los distintos niveles de prevención a nivel poblacional (11, 12), descrito en la Figura 3: § Prevención primordial: Representa el punto focal de transición de la salud a la enfermedad, también conocida como promoción de la salud, y consiste en impedir la aparición de los factores de riesgo que predisponen al desarrollo de la patología. § Prevención primaria: Basada en métodos de control de los factores de riesgo que buscan evitar el surgimiento de la enfermedad. § Prevención secundaria: Dirigida a diagnosticar la enfermedad una vez instaurada, en un estadio lo más precoz posible para disminuir su impacto y consecuencias. § Prevención terciaria: Cuya finalidad radica en limitar o reducir las complicaciones y secuelas derivadas de la enfermedad y de esta forma, conseguir una disminución en su morbi-mortalidad, mejorando así la calidad de vida de los pacientes que la padecen y optimizando su pronóstico (13). 17 Figura 3. Niveles de prevención poblacional. En el período pre-patogénico, es importante identificar la tríada que da origen a la aparición de la enfermedad, caracterizada por la interacción entre el huésped, los agentes y el medio ambiente. Dentro del período patogénico, se destacan las fases sub-clínicas, previa al desarrollo de síntomas, y la fase clínica, con las distintas herramientas terapéuticas aplicables en cada caso particular. La Sociedad Europea de Cardiología ha evaluado recientemente el grado y efectividad de los programas de prevención adoptados a nivel europeo a través del estudio EUROASPIRE V (14). Se investigaron 6.321 casos (entre entrevistas a pacientes y registro de historias clínicas), y se evidenció globalmente un regular control de los factores de riesgo CV, donde sólo el 47% de los pacientes alcanzaban las metas de tensión arterial, el 46% los objetivos de lípidos y el 65% los de hemoglobina glicada (HbA1c) (14), demostrando que el potencial de mejora en relación al manejo clínico de los factores de riesgo es sustancial (13). 3.1.1. Factores de riesgo cardiovascular Los factores de riesgo representan hábitos específicos, comportamientos o condiciones que incrementan el riesgo de padecer enfermedad CV. Las guías de prevención clínica de la ECV se basan esencialmente en el establecimiento de dos objetivos: por un lado, la detección temprana de los distintos factores de riesgo, y por el otro, la estimación del riesgo CV global de un individuo, con la finalidad de desarrollar una serie de metas y prioridades terapéuticas individualizando el tratamiento según las características y preferencias de cada persona (4). Historia natural de la enfermedad y niveles de prevención Período pre-patogénico Período post-patogénico Prevención primordial Prevención primaria Prevención secundaria Prevención terciaria Medio ambiente Agente Huésped § Acciones poblacionales § Control de factores de riesgo cardiovascular Fase sub-clínica Fase clínica § Diagnóstico precoz § Tratamiento dirigido § Limitación del daño § Rehabilitación 18 La estimación del riesgo cardiovascular se lleva a cabo empleando distintos subgrupos de edad en combinación con la presencia de factores de riesgo CV. Las escalas de riesgo más utilizadas en la actualidad corresponden a: 1. La escala de riesgo de Framingham, derivada del clásico estudio poblacional multigeneracional iniciado en 1948 en la ciudad homónima (15). 2. La evaluación sistemática del riesgo coronario (SCORE 2) y su adaptación para personas de edad mayor de 70 años de edad (SCORE 2-OP), diseñados por la Sociedad Europea de Cardiología (16, 17). 3. La ecuación de riesgo de cohorte agrupada (PCRE) elaborada por la Asociación Americana del Corazón (18). Las recomendaciones de las escalas se encuentran clasificadas en bajo, moderado o alto riesgo estimado en un plazo de tiempo específico, y los factores de riesgo son ajustados a la edad para evitar el sub-tratamiento en pacientes jóvenes y la sobre-indicación en pacientes más ancianos. Un concepto importante a remarcar es que, si bien como se ha visto el riesgo CV aumenta en forma proporcional a la edad, el beneficio total obtenido por una intervención resultará considerablemente mayor en individuos más jóvenes debido a que poseerán un tiempo de tratamiento efectivo más prolongado. Los factores de riesgo CV, a su vez, han sido clasificados en no modificables, es decir, aquellos que no son pasibles de ser alterados por ninguna intervención; y modificables, en los que la instauración de una terapéutica específica puede controlar o corregir el mismo (19): § No modificables: Edad, genética, sexo. § Modificables: Hipertensión arterial, diabetes mellitus, dislipemia, tabaquismo, dieta, sedentarismo, obesidad y factores psico-sociales. El estudio de casos y controles INTERHEART realizado en 15.152 pacientes a través de 52 países demostró que un 92% de los casos de cardiopatía isquémica se asociaban directamente con alguno o varios de estos factores de riesgo (1, 20). A su vez, numerosos estudios también evidenciaron que la combinación de factores de riesgo conductuales como el tabaquismo, el sedentarismo, la dieta de pobre calidad y el consumo excesivo de 19 alcohol contribuyen al 60% de todas las muertes prematuras, reduciendo entre 7 a 18 años la expectativa de vida global de un individuo (21-23). Asimismo, un estudio de cohortes basado en dos investigaciones poblacionales a gran escala (The Nurses’ Health Study que incluyó 73.196 individuos entre 1980 a 2014 y el Health Professionals Follow-Up Study con un total de 38.366 personas desde 1986 hasta 2014) advirtió que la adopción de un estilo de vida saludable resultaba en una expectativa de vida libre de diabetes, cáncer y ECV sustancialmente mayor (24). En la misma línea, el Malmö Diet and Cancer Study realizado en Suecia en 26.323 personas con un seguimiento a 18 años, evidenció que la adopción de conductas de vida beneficiosas (definidas por no fumar, peso balanceado, actividad física regular y dieta saludable) se asociaban a una disminución del 44% en el riesgo de desarrollar ECV (25). Por su parte, el estudio Global Burden of Disease realizó una evaluación comparativa del riesgo CV a través de 195 países entre 1990 y 2017, y objetivó que el 61% de las muertes totales (intervalo de confianza - IC 95%, 59,6–62,4%) y el 48% de los DALYs (IC 95%, 46,3– 50,2%) fueron debidas a factores de riesgo CV (26). Durante el período de tiempo estudiado, se observó también una reducción importante en la exposición a riesgos conductuales y ambientales, contrarrestado por un incremento en la aparición de factores de riesgo metabólicos (encabezado por un aumento del 50% en la obesidad y 25% en la DM) (7, 26). La Figura 4 detalla la contribución particular de cada factor en el riesgo de padecer cardiopatía isquémica. 20 Figura 4. Contribución relativa de factores de riesgo cardiovascular en el desarrollo de cardiopatía isquémica, estratificada por sexo. Modificado de (27). A continuación, se desarrollarán la epidemiología y características esenciales de los principales factores de riesgo CV establecidos. 3.1.1.1. Factores de riesgo cardiovascular no modificables § Edad En 2019, la población mayor de 65 años en la Unión Europea alcanzó el 17,2% del total (rango intercuartílico – RIQ, 12,1-20,0%), número que se ha visto duplicar en las últimas 5 décadas, con una expectativa de vida media actual de 77,5 años (RIQ 74,9–81,7 años) (2). El 80% de las muertes CV se producen en personas mayores de 65 años de edad, y la mortalidad de causa cardíaca representa la primera causa de muerte en este segmento poblacional (28). Esto podría explicarse, en parte, dado que la edad se asocia a la presencia de varios factores de riesgo combinados, así como también por trastornos a nivel de la fisiología vascular derivados del envejecimiento celular que predisponen directamente al desarrollo de ECV (28). Otro concepto importante relacionado a la edad resulta el de fragilidad, que responde a un estado multi-dimensional caracterizado por una vulnerabilidad importante frente a factores externos (4). Si bien éste no resulta equivalente a la edad biológica, un número 68,1% 55,5% 43,0% 18,3% 11,6% 25,3% 10,6% 69,7% 53,1% 40,5% 16,8% 27,1% 25,9% 9,6% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% Dieta Hipertensión arterial Dislipemia Obesidad Tabaquismo Glucemia alterada en ayuno Sedentarismo Muertes atribuidas a factores de riesgo cardiovascular (%) Sexo masculino Sexo femenino 21 sustancial de individuos con fragilidad corresponden a personas de edad avanzada. Existe una clara asociación demostrada entre el grado de fragilidad y la aparición de eventos CV mayores y mortalidad CV (29-31). Pero, a diferencia de la edad, constituye un indicador pasible de ser modificado mediante intervenciones en el estilo de vida. § Genética La herencia familiar en cardiopatía isquémica fue descrita por primera vez en 1939 (32), y desde entonces se han descubierto numerosos genes relacionados con la aparición de ECV (33). Existen en la actualidad diversas escalas de riesgo poligénicas que incluyen la identificación de distintas variables genéticas relacionadas con el desarrollo de ECV, y permiten mejorar la predicción del riesgo CV de un individuo (tanto en prevención primaria como secundaria) (34, 35). Los estudios que evaluaron el riesgo CV utilizando la aplicación de escalas poligénicas, demostraron que aquellos pacientes con alto riesgo genético poseían un incremento del 91% en el riesgo de padecer cardiopatía isquémica (36). Sin embargo, es importante recalcar que la adopción de hábitos de vida saludable (como el ejercicio físico regular, control adecuado de factores de riesgo y una dieta saludable) produce una disminución del 46% en la aparición de eventos CV en forma independiente a la carga genética de un individuo (36), por lo que la incorporación de estas variables y su rendimiento dentro de las escalas continúa siendo discutido (37). § Sexo Las guías de manejo clínico de la ECV reconocen la importancia de integrar apropiadamente el sexo y género del individuo dentro de la toma de decisiones terapéuticas, de la misma forma que resulta fundamental asegurar una apropiada representación y diversidad de éstos en el diseño de estudios clínicos (38, 39). La Organización Mundial de la Salud (OMS) define al sexo de un individuo como las características biológicas y fisiológicas que lo componen, mientras que género representa la construcción y modelo social elaborado que define a la persona y sus relaciones con el medio (40). Así, este factor de riesgo presenta un comportamiento bimodal, donde por un lado el sexo constituye un parámetro fijo, mientras que el género es un factor que promueve la aparición de cambios funcionales a nivel epigenético pasibles de ser modificados (4). Actualmente, como se ha mencionado, el sexo femenino registra una mayor prevalencia de ECV en Europa en comparación al sexo masculino (60 millones vs. 53 millones, respectivamente), así como una mayor incidencia de nuevos casos (2). Sin embargo, la 22 prevalencia media estandarizada por edad continúa siendo menor para mujeres que hombres (6.369 [RIQ 5.385–7.139] vs. 7.586 [RIQ 5.963–8.143] respectivamente) (2). El sexo femenino se caracteriza por presentar una edad media mayor en la aparición de ECV, con una tasa superior de factores de riesgo asociados y una mayor proporción de complicaciones derivadas tanto de la enfermedad como su tratamiento, todo lo cual redunda en una tasa de mortalidad superior (41). 3.1.1.2. Factores de riesgo cardiovascular modificables § Hipertensión arterial La HTA constituye un factor de riesgo primario, presentando una relación directa entre el aumento en los valores de tensión arterial (TA) y el desarrollo de ECV (42). La prevalencia de HTA en países europeos es del 25% (RIQ 19,9-28,5%), habiéndose observado una reducción de la misma del 30% en los últimos 40 años (2). Un meta-análisis de 61 estudios prospectivos con más de 1 millón de individuos incluidos demostró que la HTA incrementa significativamente el riesgo de sufrir todos los espectros de la enfermedad aterosclerótica (42), siendo responsable de 9,4 millones de muertes a nivel global y un 7% de DALYs (43). Sin embargo, aún hoy la definición actual de HTA resulta controvertida. La Asociación Americana del Corazón define la HTA como una TA sistólica (TAS)>130 mmHg y una TA diastólica (TAD)> 80 mmHg, mientras que la Sociedad Europea de Cardiología lo hace con valores de TAS>140 mmHg y TAD> 90 mmHg (4, 44). Esta diferencia radica principalmente en los hallazgos del estudio SPRINT (45), donde un objetivo de TAS<120mmHg se asoció a una disminución significativa en los eventos CV en comparación a TAS<140 mmHg, aunque la presencia de confundidores tales como una incidencia menor de pacientes de alto riesgo y el hecho que el tratamiento intensivo de la TA produjo una mayor tasa de efectos adversos, limitó sensiblemente los hallazgos obtenidos (46). Independientemente de la meta de TA elegida, se ha calculado que la erradicación de la HTA podría conseguir una disminución en la mortalidad CV total de un 34% (47). § Diabetes mellitus La DM es una patología caracterizada por una desregulación en la homeostasis de la glucemia, clasificándose en distintos subtipos de acuerdo con el mecanismo fisiopatológico que le da origen (tipo I por supresión de islotes pancreáticos de Langerhans funcionales -5 a 10% del total-; tipo II secundaria a una resistencia a la acción sistémica de 23 la insulina -90 a 95% del total). Constituye un factor de riesgo mayor independiente para el desarrollo de enfermedad vascular aterosclerótica. La prevalencia de diabetes se encuentra en franco ascenso a nivel global evidenciada a través de un aumento del 189% en los últimos 30 años (a expensas de la DM tipo 2) principalmente derivada de una epidemia mundial de obesidad, sedentarismo y malnutrición (48, 49). Se estima que 422 millones de personas en todo el mundo conviven con esta enfermedad (60 millones a nivel europeo), y proyectándose un incremento hasta 693 millones antes de mitad del siglo XXI (50). En un meta-análisis de aproximadamente 1 millón de individuos, la DM presentó una asociación directa con mortalidad por cualquier causa tanto en hombres (riesgo relativo - RR 1,59 [IC 95%, 1,54-1,65]) como mujeres (RR 2,00 [IC 95%, 1,90-2,11]) (51), así como con la aparición de cardiopatía isquémica, AVC y mortalidad de causa CV (52). Adicionalmente, las posibilidades de padecer enfermedad microvascular (especialmente neuropatía, nefropatía y retinopatía) son significativamente mayores, impactando en la calidad de vida de los pacientes que la padecen, y representando la sexta causa mundial de discapacidad (53). § Dislipemia La dislipemia, particularmente la elevada carga de moléculas lipídicas pro-aterogénicas que contienen apoB, tales como el colesterol total (CT) y el colesterol transportado por lipoproteínas de baja densidad (C-LDL de low-density lipoprotein), han demostrado poseer una fuerte asociación con la aparición de eventos CV. La prevalencia de hipercolesterolemia en la población general excede el 50% en países de ingresos altos (2), con valores promedio de CT en la Unión Europea de 188,3 mg/dl (RIQ 179,0-192,1 mg/dl), y una tendencia actual en descenso (11% en las últimas décadas). A pesar de ello, se estima que la dislipemia es responsable directa de 4,4 millones de muertes en todo el mundo (54). La prevalencia de enfermedad aterosclerótica se incrementa linealmente con el aumento proporcional en los valores de C-LDL (55), en donde la exposición prolongada aún a valores modestos de colesterol (C-LDL >100 mg/dl) se relacionan con un aumento del 64% en el riesgo de padecer ECV (56). Por su parte, su tratamiento reduce significativamente el desarrollo de estos eventos, donde por cada 1 mmol/L (39 mg/dL) de disminución del C-LDL se reduce un 12% la mortalidad total y un 23% el riesgo de cardiopatía isquémica (57). El estudio HOPE-3 demostró que el tratamiento de la dislipemia en pacientes sin ECV establecida redujo en forma significativa un 24% la aparición del punto final primario compuesto de mortalidad CV, infarto agudo de miocardio (IAM) no fatal y AVC (IC 95%, 0,64-0,91) (58). 24 § Tabaquismo El tabaquismo, por sí sólo, es responsable de un 50% de la mortalidad total en fumadores, siendo la mitad de éstas de causa CV (4). Se calcula que el tabaquismo reduce en hasta 10 años la expectativa de vida de un fumador (59), incrementa en 5 veces el riesgo de padecer cardiopatía isquémica (60) y duplica el riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca (IC) (61). Luego de la HTA, el tabaquismo es el segundo factor principal causante de mortalidad y productor de DALYs, siendo responsable de 8,7 millones de muertes anuales globalmente (26). La cesación tabáquica ha demostrado reducir la tasa de eventos CV en un 39% a 5 años, aunque se estima que deberían pasar hasta 25 años para que el riesgo se equipare al de una persona no fumadora (62). Las estrategias de salud pública destinadas a reducir el tabaquismo activo han evidenciado disminuir la tasa de fumadores en la Unión Europea en los últimos 15 años (63), estimándose su prevalencia actual en un 22,1% (RIQ 17,0-26,5%) (2). § Dieta De acuerdo al estudio Global Burden of Disease, un 52% de todas las muertes de origen CV serían atribuibles a condiciones directamente relacionadas con una dieta no saludable (26). A nivel europeo, esta cifra se encuentra aproximadamente en 2,1 millones de personas (un 49,2% de las muertes CV y un 22,4% de las muertes totales) (7, 26), calculándose que una mejora en la calidad de patrones alimentarios evitaría 1 de cada 5 muertes actuales (64). En cuanto a la composición de la dieta, un meta-análisis de más de 200.000 personas evidenció una asociación directa entre el consumo de grasas trans y mortalidad total (65), mientras que su reemplazo por grasas poliinsaturadas reduciría el riesgo de desarrollar ECV en un 13% (66). Por otra parte, el consumo excesivo de azúcar ha sido relacionado con el desarrollo de obesidad y DM tipo 2, mientras que el exceso de sodio incrementa el riesgo de HTA, ambos impactando directamente sobre el pronóstico CV (67, 68). Asimismo, el empleo de patrones dietarios con propiedades beneficiosas ha generado una mejora considerable en el riesgo CV de las personas. La dieta mediterránea consiste en un plan de alimentación saludable basado en el consumo de vegetales (frutas y verduras) asociado a alimentos con alto contenido de fibra, siendo el aceite de oliva virgen extra la principal fuente de grasas insaturadas. El empleo de este tipo de dieta ha evidenciado disminuir un 19% el riesgo de muerte CV, un 30% el riesgo de IAM y un 27% el riesgo de AVC (69). Por 25 otro lado, la dieta DASH (Dietary Approaches to Stop Hypertension, es decir, enfoques dietarios para detener la HTA) corresponde a una propuesta alimentaria basada en alimentos reducidos en sodio. En un meta-análisis de 33 estudios controlados, se asoció a una reducción significativa tanto de la TAS como TAD, aunque también demostró impacto sobre el CT, HbA1c y peso corporal (70). § Sedentarismo La actividad física regular promueve una disminución del riesgo de padecer ECV a través de varios mecanismos: reducción en la TA y peso corporal, regulación de los niveles glucemia al mejorar la sensibilidad a la insulina, y modulación del metabolismo lipídico virando hacia un perfil menos aterogénico (71). La actividad física suficiente desde el punto de vista cardioprotector ha sido definida como la realización de 150 minutos de ejercicio de moderada intensidad o 75 minutos de ejercicio de alta intensidad por semana (72), aunque igualmente tiempos menores de practica aeróbica han demostrado tener efectos beneficiosos (73). El sedentarismo, por el contrario, incrementa el riesgo de sufrir diabetes, dislipemia y aumenta el riesgo de aparición de insuficiencia cardíaca y enfermedad aterosclerótica (74), siendo responsable de hasta el 30% de los casos de ECV y un 10% de la mortalidad global (2, 75). Se estima actualmente que un 30% de la población mundial adulta es inactiva (76), más pronunciado en mujeres que hombres (1), y la adopción de actividad física periódica ha evidenciado en un meta-análisis disminuir en promedio un 20% el riesgo de desarrollar cardiopatía isquémica y AVC (77). § Obesidad En las últimas décadas, se ha constatado un aumento progresivo en la media del índice de masa corporal (IMC) de la población a nivel mundial (78), en donde un 20% presenta algún grado de obesidad, y habiéndose duplicado dicha tasa en los últimos 35 años (2). Varios meta-análisis incluyendo más de 30 millones de individuos han demostrado una relación lineal ente el aumento del IMC y mortalidad total, así como con la aparición de DM tipo 2 y ECV (79-81). Asimismo, se ha encontrado una asociación directa entre obesidad y la aparición de muerte súbita arrítmica y el desarrollo de fibrilación auricular (FA) (82, 83). No obstante, existe una contradicción originada en el análisis de revisiones sistemáticas previas denominada la “paradoja de la obesidad”, en donde niveles determinados de obesidad han sido encontrados protectores frente a la ECV, aunque probablemente dichas 26 conclusiones se deban a variabilidad y sesgos presentes en dichos estudios, no habiendo podido ser corroborada fehacientemente (84, 85). A pesar de todo, las estrategias destinadas al tratamiento de la obesidad son limitadas, y consisten principalmente en fármacos miméticos de la incretina que promueve reducciones del peso corporal, y la cirugía bariátrica, que ha demostrado reducir eventos CV mayores (86, 87). § Factores psico-sociales Los factores psico-sociales dan cuenta de un conjunto de trastornos relacionados con el estrés psíquico, el comportamiento y las relaciones en sociedad (4). Los factores psíquicos incluyen la depresión, la sensación de soledad y otros trastornos mentales, que se ha visto incrementan el riesgo de padecer patología CV (88), y predisponen a presentar una mayor tasa de factores de riesgo conductuales (mala alimentación, sedentarismo, tabaquismo), así como una mala adherencia al tratamiento, incrementando de por sí el riesgo global (89). De la misma manera, indicadores positivos de salud mental (como resiliencia y optimismo) han demostrado comportarse como factores protectores frente a la ECV (90). Por su parte, un nivel socioeconómico bajo y el estrés laboral han sido directamente asociados con la aparición temprana de eventos vasculares y mortalidad (91), en forma independiente al resto de los factores de riesgo clásicos (92). 3.2. Fisiopatología de la cardiopatía isquémica La cardiopatía isquémica representa el proceso evolutivo final producto de la influencia de los factores de riesgo CV en el desarrollo de enfermedad aterosclerótica a nivel cardíaco. Se manifiesta a través de la progresión de placas de aterosclerosis en pared vascular de las arterias coronarias, que en condiciones fisiológicas son responsables del aporte sanguíneo al músculo cardíaco, y en este contexto, se compromete el flujo coronario en forma creciente según el avance de la enfermedad. De esta forma, se generan cuadros de hipoxia celular que en situaciones más avanzadas pueden llegar hasta la necrosis y apoptosis de cardiomiocitos durante el curso de un IAM. Por lo tanto, la aterosclerosis será el mecanismo central que marcará el curso y pronóstico de esta enfermedad. 3.2.1. Aterosclerosis 3.2.1.1. Mecanismos de disfunción endotelial y respuesta inflamatoria local 27 La aterosclerosis es un proceso inflamatorio sistémico, crónico y progresivo, que constituye el mecanismo fisiopatológico central de la enfermedad CV isquémica (93). La patología aterosclerótica consiste en un proceso continuo desde la aparición de las primeras placas de aterosclerosis a nivel arterial en forma subclínica, hasta el desarrollo de isquemia secundaria a obstrucción vascular, que se inicia en etapas tempranas en la vida de un individuo y se manifiesta tardíamente en forma de eventos CV mayores (93). Por lo tanto, su diagnóstico precoz constituye un pilar fundamental en la prevención y tratamiento de la ECV (94). La aterosclerosis se caracteriza por una acumulación gradual y sostenida de partículas lipídicas en la pared arterial vascular, que promueven la inducción de una respuesta pro- inflamatoria asociada (95). El depósito de ésteres de colesterol en las arterias fue descubierto por Nikolai Anichkov a comienzos del siglo XX, y ha sido reconocido desde entonces como un mecanismo esencial para el desarrollo de dicho proceso (96). En forma análoga, Rudolph Virchow propuso en el siglo pasado la participación directa de la respuesta inflamatoria sistémica en el establecimiento de las lesiones ateroscleróticas. (97). Ambos factores confluyen y promueven un proceso inicial determinado principalmente por la aparición de disfunción endotelial. El endotelio representa la capa celular interna de la pared vascular, pero excede ampliamente su función de barrera estableciéndose como un verdadero órgano endocrino (98). Las células endoteliales cumplen múltiples funciones básicas para el mantenimiento de la homeostasis, regulando el flujo sanguíneo selectivo, controlando el equilibrio entre vasoconstricción y vasodilatación, interactuando directamente con el sistema inmune y de coagulación modulando así su actividad, y permitiendo la internalización de macromoléculas, hormonas y factores específicos para su procesamiento a nivel de las distintas estirpes celulares (98). Sin embargo, la exposición vascular continua a los factores de riesgo CV mencionados previamente induce progresivamente un daño a nivel del endotelio que conlleva a una alteración en la función endotelial e incrementa la permeabilidad de esta capa, favoreciendo la incorporación de partículas de C-LDL al espacio subendotelial (99). Una vez en el espacio intimal, estas partículas sufren un proceso de modificación química y estructural convirtiéndose en moléculas oxidadas (LDLox), agregadas (LDLag) o acetiladas (LDLac) (97, 100). Estas LDL modificadas estimulan el desarrollo de una respuesta inflamatoria mayor a ese nivel que promueve la progresión de la lesión aterosclerótica. La respuesta pro-inflamatoria se caracteriza por el reclutamiento de distintos tipos celulares (principalmente monocitos y linfocitos) al lugar de la lesión (101). Inicialmente, los monocitos reclutados transmigran hacia el espacio subendotelial donde se diferencian a macrófagos, células encargadas de captar las moléculas de LDLox y LDLac en forma de 28 ésteres lipídicos, otorgándoles la característica apariencia histológica de células espumosas (97). Estos macrófagos saturados de partículas lipídicas potencian a su vez una respuesta inflamatoria tardía más sostenida que permite la activación de células endoteliales. Estas células endoteliales activadas estimulan la vía de señalización mediada por el factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B (NF-kB), que promueve la liberación de mediadores químicos específicos como endotelina, E-selectina, la proteína 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), produciendo la adhesión de una mayor cantidad de células inflamatorias al endotelio activado (102). Por otro lado, la posterior formación de cristales de colesterol por las moléculas de LDLag desencadena en paralelo la activación del sistema inmune innato a través del receptor de clúster de diferenciación 36 (CD-36), e induce la activación del complejo inflamasoma dominio de pirina de la familia NLR 3 (NLRP3), encargado de clivar los precursores de las interleuquinas 1b y 18 (IL-1b e IL-18) hacia sus configuraciones activas (103, 104). Todo ello desencadena una respuesta inmune específica mediada por linfocitos T, liberando enzimas que degradan la matriz extracelular e incrementando la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés, de “reactive oxygen species”) (105). Se estima que hasta un 25% de los leucocitos presentes en las lesiones ateroscleróticas corresponden a linfocitos T CD3+, mientras que los linfocitos T CD3+CD4+ corresponden a un 10% del total. Estos se encuentran predominantemente a nivel de la capa fibrosa de la placa, y su reclutamiento ocurre a través de los receptores de quimioquinas 5 y 6 (CCR 5 y 6), cumpliendo una función regulatoria de la respuesta inflamatoria local (106). Este proceso genera una mayor liberación de factores pro-inflamatorios y de adhesión leucocitaria que incrementan la infiltración inmunitaria subintimal. Por otro lado, las células musculares lisas inherentes a la capa media vascular son expuestas a dichos factores inflamatorios, citoquinas y productos de oxidación lipídica estimulando una modificación de su fenotipo contráctil hacia un modo proliferativo, mediado por la vía del factor 4 simil-Kruppel (KLF4), con el objetivo de migrar hacia la capa íntima vascular y colaborar en la fagocitosis de los depósitos de colesterol en su interior, adoptando así un estado similar a los macrófagos, al punto de expresar marcadores macrofágicos en su superficie (107). De hecho, se considera que hasta el 50% de las células inflamatorias en las lesiones ateroscleróticas corresponderían a este estado modificado de células musculares lisas (108). La acumulación continua de ésteres de colesterol internalizados en células macrofágicas y musculares genera una toxicidad celular progresiva, que termina por desencadenar una respuesta de estrés mediada por el retículo endoplásmico provocando la liberación intracelular de calcio e induciendo la activación de caspasas que inician el programa de 29 apoptosis celular y necroptosis (109). La apoptosis sucede principalmente en etapas iniciales de la enfermedad y promueve así la apropiada eliminación de los restos celulares dentro de las lesiones ateroscleróticas para limitar así su crecimiento. La necroptosis, por el contrario, ocurre en etapas más avanzadas y suscita primordialmente un incremento en la respuesta inflamatoria, que termina por perpetuar el avance de este proceso (110). Por otro lado, las lipoproteínas oxidadas estimulan un mecanismo denominado hematopoyesis clonal de potencial indeterminado en la médula ósea, que consisten en cambios somáticos epigenéticos aleatorios en las células madre hematopoyéticas durante el transcurso de la vida del individuo, y ha sido relacionado a una respuesta pro-inflamatoria acelerada (111, 112). Se cree que estas alteraciones ocurren en todos los tipos celulares, pero al ser las células madre hematopoyéticas una estirpe expuesta a una tasa superior de división celular, sus modificaciones se producirían en forma más frecuente. Se ha visto que estos cambios epigenéticos no conllevan de por sí un riesgo aumentado de desarrollar tumores, pero si han demostrado su asociación con un incremento en la mortalidad total cercana al 20%, a expensas predominantemente de la aparición de ECV aterosclerótica (113, 114). Una de las mutaciones identificadas en este proceso corresponde al gen de la enzima Tet Metilcitosina Dioxigenasa 2 (TET2), que induce la expresión del complejo inflamasoma NLRP3 y la subsecuente respuesta inflamatoria que contribuye a la progresión del proceso aterosclerótico (115). 3.2.1.2. Placa aterosclerótica vulnerable y proceso de aterotrombosis Durante el crecimiento de la placa aterosclerótica, los procesos inflamatorios y de oxidación estimulan la acción de metaloproteinasas y fosfolipasas que producen la degradación del colágeno y matriz extracelular (116). De esta forma, se reduce paulatinamente el grosor de la capa fibrosa que recubre la lesión, volviendo así la placa vulnerable a ruptura o erosión (117, 118). La Figura 5 esquematiza los procesos intervinientes en la formación y crecimiento de la placa de aterosclerosis a nivel vascular. 30 Figura 5. Esquema de progresión de la enfermedad aterosclerótica. Una vez que se produce la pérdida de solución de continuidad de la placa de aterosclerosis, se genera la exposición de estructuras vasculares o componentes de núcleo necrótico a la circulación sanguínea desencadenando la activación del factor tisular y la propia cascada de la coagulación, dando lugar al inicio de la respuesta hemostática con la posterior formación de una monocapa de fibrina, para estimular el reclutamiento de plaquetas circulantes y células inflamatorias al lugar de lesión. En el proceso hemostásico, la interacción del factor de von Willebrand (VWF) a través de su domino A3 con el colágeno vascular expuesto constituye el paso inicial en la respuesta de adhesión plaquetar, proporcionando así un punto de anclaje para las plaquetas a través de la interacción del receptor plaquetar glicoproteína (GP) Ib-IX-V con el dominio A1 del VWF. Este primer contacto plaquetar-vascular se ve reforzado por la interacción directa del colágeno con los receptores plaquetares GPIa y la GPVI (119, 120). Una vez activadas, las plaquetas liberan difosfato de adenosina (ADP) y tromboxano A2 (TXA2), entre otros agonistas (121). El ADP puede unirse a dos receptores acoplados a proteínas G presentes en la superficie de la plaqueta, el receptor purinérgico P2Y1 y P2Y12 (119). Por un lado, la unión del ADP con el receptor P2Y1 deriva en un incremento en la concentración de calcio intracelular, así como en un cambio conformacional de las plaquetas, lo cual conlleva a una respuesta débil y transitoria de agregación plaquetaria. Por el contrario, la interacción del ADP con el receptor plaquetar P2Y12, además de perpetuar el aumento de calcio, disminuye los niveles de monofosfato cíclico de adenosina (cAMP), con la consecuente agregación plaquetaria irreversible (120). Aumento de permeabilidad vascular Placa vulnerable Reducción de la capa fibrosa Disfunción endotelial Endotelio sano Incremento en la captación de lípidos Adhesión y migración leucocitaria Factores de riesgo cardiovascular Daño oxidativo Modificaciones enzimáticas y agregación lipídica Formación de células espumosas Migración de células musculares lisas Síntesis de matriz extracelular Formación de capa fibrosa Apoptosis y necrosis de células espumosas Placa de aterosclerosis Activación del sistema inmune innato y adquirido Reducción de la capa fibrosa 31 En cuanto al TXA2, éste se produce por la activación de la enzima fosfolipasa A2 y la resultante liberación de ácido araquidónico de la membrana de la plaqueta. El ácido araquidónico liberado interacciona con la enzima ciclooxigenasa-1 (Cox-1) dando lugar a la formación de TXA2 quien, a su vez, perpetúa el incremento en los niveles intracelulares de calcio. Finalmente, la trombina, sintetizada en el plasma tras la activación de la cascada de coagulación, interacciona con el receptor de la trombina proteasa-activada tipo 1 (PAR-1) en la superficie de la plaqueta produciendo un aumento adicional en los niveles de calcio y activación de la fosfolipasa C (120). Todo ello deriva en el cambio conformacional y la consiguiente activación del receptor plaquetar GPIIb/IIIa, que constituye el receptor plaquetar más abundante. La unión del fibrinógeno circulante con el receptor GPIIb/IIIa da lugar a la formación de puentes entre las plaquetas activadas induciendo la formación de agregados plaquetares estables que actúan en conjunto con los factores de coagulación activados en la formación del complejo trombótico, terminando en una oclusión de la luz arterial y desencadena los fenómenos de isquemia celular e infarto tisular (120). La Figura 6 Ilustra el proceso completo de la enfermedad aterosclerótica, desde sus inicios con la activación y disfunción endotelial, el ingreso de lipoproteínas a la pared arterial; seguido de la inducción de la respuesta inflamatoria, la remodelación vascular y la migración de células musculares lisas modificadas; con la subsiguiente formación de la capa fibrosa y su evolución hasta la desestabilización y exposición de factores con activación de la respuesta aterotrombótica. Figura 6. Fisiopatología de la enfermedad aterosclerótica. C-LDL: Colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad; CD: Clúster de diferenciación; CE: células endoteliales; CTK: citoquinas y 32 quimioquinas; CXCL-2: Ligando 2 de quimioquina; GP: Glicoproteína; I-CAM: Molécula de adhesión intercelular 1; IL: Interleuquina; NO: óxido nítrico; LDL: lipoproteínas de baja densidad; oxLDL: LDL oxidada; agLDL: LDL agregada; LOX-1: receptor de LDL oxidada tipo lectina 1; MCP-1: proteína quimotáctica de monocitos 1; MMP: metaloproteinasas; PSGL-1: ligando de selectina P 1; V-CAM: Molécula de adhesión vascular 1; VWF: Factor de Von Willebrand. Modificado de (121). 3.2.2. Cardiopatía isquémica e infarto agudo de miocardio 3.2.2.1. Diagnóstico y clasificación La cardiopatía isquémica constituye la patología clínica final producto del desarrollo íntegro de la enfermedad aterosclerótica y la activación de los fenómenos aterotrombóticos a nivel cardíaco. Estos procesos se generan de forma súbita provocando la sub-oclusión u obstrucción completa de la circulación coronaria en forma aguda, dando lugar así a la isquemia celular y el daño miocárdico subsecuente. De esta forma, esta entidad da origen a los síndromes coronarios, que, basados en sus patrones electrocardiográficos podrán clasificarse en dos fenotipos particulares con bases fisiopatológicas propias y pronósticos diferenciales (Figura 7): § Síndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST (SCASEST): responde al desarrollo de isquemia miocárdica intermitente por obstrucción coronaria parcial (angina inestable), pudiendo progresar en grados más avanzados hacia la injuria y necrosis de cardiomiocitos (IAMSEST). § Síndrome coronario agudo con elevación del segmento ST (SCACEST): se caracteriza por una obstrucción aguda total que da lugar al IAM con elevación del segmento ST (IAMCEST), generalmente asociado a un monto isquémico miocárdico sustancialmente mayor, cuya afectación y pronóstico dependerá esencialmente del territorio vascular comprometido y del tiempo de isquemia transcurrido (122). 33 Figura 7. Clasificación del infarto agudo de miocardio con su correlación histológica y electrocardiográfica (123, 124). El IAM se caracteriza por la presencia de daño miocárdico, definido por la elevación de biomarcadores de injuria cardíaca (principalmente troponina de alta sensibilidad) por encima del percentilo 99 del valor de referencia, asociado a evidencia de isquemia miocárdica demostrable a través de la aparición de síntomas, hallazgos en estudios de imágenes (invasivos y no invasivos) o en la evaluación histopatológica (125). Según el sustrato fisiopatológico, el IAM puede clasificarse en distintos subgrupos (125): § Tipo I: desencadenado por la desestabilización de la placa aterosclerótica vulnerable con su consiguiente erosión/ruptura y establecimiento del proceso aterotrombótico coronario. § Tipo II: existencia de un desequilibrio entre el aporte y la demanda miocárdica de oxígeno y nutrientes, secundario a la aparición de distintos fenómenos (i.e., anemia, hemorragia, taquiarritmia) con la presencia o no de enfermedad aterosclerótica no complicada. § Tipo III: se caracteriza por la muerte súbita de origen cardíaco como primera manifestación del síndrome coronario, previo a la posibilidad de poder obtener muestras de enzimas cardíacas para su análisis, con la presunción de sintomatología de etiología coronaria, cambios electrocardiográficos, fibrilación ventricular o demostración del IAM por autopsia. § Tipo IV: secundario a procedimiento de intervencionismo percutáneo, producido dentro de las 48 horas del evento. Éstos pueden ser: 4a, relacionado a angioplastia Infarto agudo de miocardio Con elevación del segmento ST Trombosis oclusiva Sin elevación del segmento ST Trombosis sub-oclusiva 34 coronaria; 4b, por la aparición de trombosis intra-stent; 4c, por reestenosis intra- stent. § Tipo V: originado como complicación de una intervención quirúrgica de revascularización coronaria mediante la técnica de by-pass aorto-coronario. Es de destacar también que el IAM puede ocurrir en ausencia de demostración de trombosis o lesiones coronarias, entidad que ha sido denominada infarto de miocardio sin lesiones coronarias obstructivas (125). La cardiopatía isquémica en sí constituye un síndrome clínico de compleja base fisiopatológica (126). Las arterias coronarias son las encargadas de aportar el flujo sanguíneo directamente hacia el tejido cardíaco. Las secciones proximales de las mismas se denominan vasos epicárdicos y corresponden al recorrido arterial desde su origen en los senos de Valsalva de la aorta hasta su inserción dentro del músculo cardíaco para continuar su trayecto intra-miocárdico. Se caracterizan por ser arterias de diámetro entre 250 µm a 5 mm, de baja resistencia, que regulan el flujo vascular a través de mecanismos de vasoconstricción y vasodilatación (127). A este nivel, cuando la progresión de una placa de aterosclerosis disminuye el área transluminal en más de un 70% (con una reducción del 50% en el diámetro coronario), se produce un aumento sustancial en las resistencias proximales al sitio de la lesión, lo cual redunda en una disminución de la presión de perfusión coronaria (128). Esto se traduce en la aparición de isquemia miocárdica, inicialmente ante el aumento en las necesidades metabólicas del tejido cardíaco afectado (lo cual sucede habitualmente durante el ejercicio o esfuerzo físico), para luego al progresar el grado de obstrucción coronaria inducir una afectación gradual en estado basal de reposo. 3.2.2.2. Tratamiento de reperfusión y revascularización coronaria Las estrategias de reperfusión tienen como objetivo alcanzar una restauración del flujo sanguíneo coronario en forma temprana y completa (a nivel epicárdico y microvascular) para reducir así el tamaño final del infarto, que refleja el grado de compromiso y monto de tejido dañado durante el IAM, constituyendo uno de los principales parámetros pronósticos independientes en esta enfermedad. Debido a las mejoras en el tratamiento farmacológico así como un aumento considerable en el empleo de estrategias de reperfusión (la angiografía temprana se ha incrementado en los últimos años del 9% al 60% y la intervención coronaria percutánea -ICP- del 12,5% 35 al 67%), la consecuencia fundamental ha sido una reducción considerable de la mortalidad CV en el IAM a 6 meses del 17,2% al 6,3% (129). Las terapias de reperfusión se encuentran indicadas para el tratamiento primario del IAMCEST, en donde la circulación coronaria se detiene por completo y el daño isquémico resulta significativamente mayor de no restaurarse el flujo normal. La primera terapia de reperfusión desarrollada consistió en la administración de agentes fibrinolíticos (130), cuyos principales fármacos son la estreptoquinasa, tenecteplasa, alteplasa y reteplasa. Su acción consiste en convertir el plasminógeno en plasmina, que actúa a nivel de la fibrina produciendo una disolución del trombo intracoronario y de esta forma favorecen la reperfusión de los tejidos afectados (131). Numerosos ensayos clínicos randomizados y controlados han demostrado el beneficio de esta terapia en el IAMCEST, alcanzando una reducción significativa de la morbi-mortalidad en estos pacientes y permitiendo salvar 30 vidas de cada 1000 pacientes tratados durante las primeras 6 horas del inicio de los síntomas (132, 133). No obstante, esta terapia ha sido gradualmente reemplazada por el ICP, dada su superioridad en reducción de eventos (re-infarto y AVC) y mortalidad (134-136), siendo ésta la técnica recomendada en guías internacionales tanto para el IAM con o sin elevación del segmento ST (122, 133, 137, 138). El mecanismo se basa en la introducción periférica de forma percutánea de catéteres dirigidos hacia el sitio de oclusión coronaria a través del árbol vascular arterial, para interrumpir la obstrucción trombótica y conseguir la reperfusión del flujo sanguíneo, realizándose posteriormente una angioplastia mediante el implante de mallas metálicas (stents) recubiertos de sustancias farmacoactivas, con el fin de asegurar el mantenimiento de la apertura coronaria y evitar una re-oclusión posterior. Sin embargo, dado que la isquemia celular consiste en un proceso tiempo-dependiente, en sitios donde no existe disponibilidad precoz de empleo de técnicas de reperfusión percutáneas la terapia fibrinolítica continúa siendo una opción válida dentro de este escenario clínico (139), y en países de bajos o medianos ingresos, representan hasta el 75% de las estrategias de reperfusión empleadas dada la demora en los tiempos de acceso a la atención médica especializada (140). Aún en países de altos ingresos, un 50% de los casos no cumplen los tiempos recomendados por guías para conseguir una reperfusión a través de ICP, por lo que estos agentes continúan aún vigentes en el tratamiento de la cardiopatía isquémica (141, 142). Se recomienda iniciar la terapia fibrinolítica dentro de los 10 minutos desde el diagnóstico inicial del IAMCEST, tanto en ámbito hospitalario como pre- hospitalario (143, 144). La ICP, por su parte, debería ser realizada en forma expeditiva dentro de los 120 minutos desde el comienzo de síntomas, y en centros con un alto volumen de casos, lo cual ha demostrado asociarse a una significativa reducción de mortalidad y eventos CV (134, 145). 36 En cuanto a la revascularización mediante cirugía de by-pass aorto-coronario, esta técnica permite el injerto de puentes arteriales o venosos en forma quirúrgica para restaurar el flujo hacia tejidos isquémicos distales al sitio de la lesión, siendo empleada principalmente en casos de enfermedad coronaria difusa con afectación de varias arterias coronarias en forma simultánea, en donde sí ha evidenciado ser superior al ICP en términos de reducción de mortalidad (146). 3.2.2.3. Tratamiento anti-trombótico La piedra angular del tratamiento farmacológico en la cardiopatía isquémica independientemente de la estrategia de reperfusión seleccionada corresponde a la terapia antitrombótica, destinada a la inhibición de los mecanismos de activación plaquetar (principalmente aspirina e inhibidores del receptor P2Y12) y del sistema de coagulación (inhibidores de la generación y activación de la trombina) que intervienen directa o indirectamente en los fenómenos aterotrombóticos mencionados previamente. La elección del fármaco o procedimiento, el momento de inicio y la duración del tratamiento dependerán de múltiples variables intrínsecas y extrínsecas (122), por lo que resulta fundamental adaptar estas estrategias a cada paciente y escenario clínico. Es importante remarcar que tanto las complicaciones isquémicas de la enfermedad, como los eventos hemorrágicos que puedan surgir del uso de estas terapias pueden impactar negativamente en el pronóstico de estos pacientes, por lo que una apropiada individualización de cada terapia es esencial (147). Dentro de los fármacos antiplaquetares, la aspirina (ácido acetilsalicílico) fue descubierto por Felix Hoffmann en 1897 (148), y actúa a través de su grupo acetil provocando la inactivación irreversible de la enzima Cox-1, suprimiendo de esta manera la producción de prostaglandina H2, precursor del TXA2, potente vasoconstrictor y activador plaquetario (149, 150). Tanto su actividad antitrombótica como sus efectos adversos sobre la mucosa gástrica se deben a la reducción consiguiente en la acción de estas prostaglandinas (151). La isoforma Cox-1 se encuentra en forma constitutiva en plaquetas e interviene en el proceso de la formación de TXA2, mientras que la isoforma Cox-2 se encuentra en el endotelio y sintetiza prostaciclina I2 (un importante vasodilatador e inhibidor plaquetar) (152). La aspirina a dosis reducidas produce una inactivación sobre la enzima Cox-1 100 veces más rápida que a nivel de Cox-2 (153), limitando la inhibición de prostaciclina I2 por Cox-2 a nivel endotelial y preservando así las funciones vásculo y cardioprotectoras de dicha enzima (154). Asimismo, la aspirina posee también un efecto antitrombótico adicional al producir la acetilación del fibrinógeno, promoviendo una respuesta fibrinolítica 37 específica (155). La inhibición selectiva de la aspirina sobre la Cox-1 a nivel plaquetario es irreversible y se mantiene durante toda la vida media de éstas (de 8 a 10 días) (156). En base a varios estudios randomizados, la recomendación de las guías en pacientes con síndromes coronarios agudos e IAM es el inicio de un esquema terapéutico basado en la doble antiagregación plaquetaria (DAPT) con aspirina en combinación a un fármaco inhibidor del receptor plaquetar P2Y12 (146, 157, 158). Los tres fármacos principales inhibidores orales del receptor P2Y12 disponibles en la actualidad son el clopidogrel, el prasugrel y el ticagrelor. El ticagrelor o prasugrel han sido recomendados por sobre el clopidogrel en pacientes con síndromes coronarios agudos debido a su mayor potencia intrínseca, con un inicio de acción más rápido y menor variabilidad interindividual (159). Un meta-análisis de 12 estudios randomizados y controlados con un total de 52.816 pacientes evidenció una mayor reducción significativa de eventos isquémicos con ticagrelor y prasugrel en comparación a clopidogrel, a expensas de un aumento en la incidencia de eventos hemorrágicos, siendo ticagrelor el único inhibidor P2Y12 que alcanzó una disminución significativa en la mortalidad (160). Posteriormente fue desarrollado el cangrelor, un inhibidor reversible endovenoso del receptor P2Y12, que ha demostrado en 3 ensayos randomizados y controlados una reducción de eventos isquémicos peri- procedimiento pero con una mayor tasa asociada de sangrados (161-163). Por su parte, la anticoagulación en contexto de un síndrome coronario agudo, especialmente durante el manejo invasivo del mismo, resulta de vital importancia para inhibir la generación y actividad de la trombina (122). La heparina sódica representa el tratamiento estándar de anticoagulación, aunque ha sido progresivamente reemplazada por las heparinas de bajo peso molecular debido a la practicidad superior en su administración, y con una menor variabilidad de efecto, quedando la utilización de otros anticoagulantes específicos como el fondaparinux, la bivalirudina y los inhibidores de la GPIIb/IIIa para situaciones seleccionadas (122). 3.3. Daño por isquemia/reperfusión El impacto de la enfermedad aterosclerótica a nivel cardíaco tras sufrir un evento isquémico dependerá fundamentalmente del grado de afectación del tejido miocárdico, es decir, el porcentaje de masa muscular que ha sufrido las consecuencias de la hipoxia celular prolongada con necrosis/apoptosis de cardiomiocitos y el desarrollo posterior del compromiso global de la función ventricular (164). Las terapias de reperfusión, indistintamente del mecanismo de base, tienen como objetivo final restaurar el flujo sanguíneo en el corazón isquémico con la finalidad de limitar el daño miocárdico y preservar así la función contráctil (165). A pesar de las mejoras observadas 38 tanto en las técnicas de revascularización como en los tiempos para su implementación, todavía persiste un considerable riesgo residual de morbi-mortalidad en esta población, con una tasa anual media de mortalidad del 7% y una incidencia de IC luego de un IAMCEST del 22% (166). El nivel de disfunción ventricular que se genera posterior a un infarto resultará principalmente del grado de severidad y tiempo de duración del IAM. Sin embargo, se ha observado tanto en forma experimental como en el ámbito clínico que este monto final puede ser agravado en forma tardía luego de la reperfusión de los tejidos, fenómeno que ha sido denominado daño por isquemia/reperfusión (I/R). Descrito en forma experimental por primera vez en 1960, se caracteriza por el daño cardíaco que tiene lugar tras la restauración del flujo sanguíneo coronario (167). Producto de la isquemia, la reducción del aporte sanguíneo (y por lo tanto oxígeno y nutrientes) ocasiona una súbita disminución en los niveles disponibles de energía celular, estimulándose como respuesta compensadora la activación de la glicólisis anaeróbica, que mantenida en forma sostenida induce una acidificación progresiva y desencadena una pérdida en la función de la bomba de sodio/potasio dependiente de adenosín-trifosfato (ATP), con el consiguiente aumento intracelular en la concentración de sodio. En consecuencia, se ponen en marcha nuevos mecanismos para intentar mantener la homeostasis celular, principalmente derivados de la activación del intercambiador de membrana de sodio/calcio que no requiere de ATP para su funcionamiento, liberándose de esta forma sodio al medio extracelular e introduciéndose calcio dentro de los cardiomiocitos, comenzando así un proceso de acumulación gradual en su interior (168). El retorno de la circulación al tejido isquémico producto de las terapias de reperfusión genera un rápido lavado de los iones de hidrógeno acumulados durante la acidificación, induciendo un nuevo gradiente de pH que promueve su compensación mediante la activación de la bomba de sodio/hidrógeno. Esto provoca un mayor depósito intracelular de sodio y potencia a su vez el intercambiador de sodio/calcio, con un balance final que resulta en la acumulación desproporcionada de calcio dentro de la célula, llegando a niveles que ponen en riesgo la supervivencia celular (169). El calcio libre en el citosol se acopla en primera instancia a la troponina C, interactuando luego con la troponina I y provocando el desplazamiento de las moléculas de tropomiosina T y troponina T. Esto permitirá la asociación entre las cadenas de actina y miosina que tienen lugar durante el proceso de contracción muscular (169). La relajación, por otra parte, que sucede normalmente en cardiomiocitos a través del secuestro de calcio dentro de distintas organelas como el retículo sarcoplásmico, la mitocondria, y mediante su expulsión por eflujo extracelular, se encuentra limitada en el contexto del daño por I/R por la elevada sobrecarga de calcio, que impide que estos mecanismos se lleven a cabo adecuadamente, 39 y por tanto los cardiomiocitos permanecen en un estado de contracción muscular sostenida adoptando una forma de hipercontractura (169). Esto queda manifestado a nivel histológico por la aparición de las características bandas de necrosis por contracción en el tejido miocárdico, producto de la desorganización de la estructura sarcomérica y la contracción celular exacerbada (170). Estos mecanismos se encuentran, a su vez, agravados por condiciones adicionales que tienen lugar durante el daño por I/R, como la activación de la enzima sarco/retículo endoplásmico ATPasa-dependiente de calcio-2 (SERCA-2), que induce la entrada de calcio en el retículo sarcoplásmico uniéndose a las proteínas fijadoras calreticulina y calcecuestrina para reducir su acumulación en el citosol. Esto genera su sobrecarga dentro de esta organela, que, al superar su límite de almacenamiento, expulsa el exceso de calcio nuevamente a través de los receptores de rianodina contribuyendo a incrementar su depósito citosólico y perpetuando los mecanismos de hipercontractura (171). Este suceso, en combinación con la inducción de la acción de calpaínas, que son proteasas de cisteína dependientes de calcio activadas por la acumulación intracelular de este ion, promueve la degradación de anquirina, soporte proteico del citoesqueleto sarcolémico e histoarquitectura celular, contribuyendo a generar una mayor pérdida en la integridad de los cardiomiocitos (172, 173). De esta forma, estas alteraciones progresivas caracterizadas por el desequilibrio iónico y de pH que perturban la homeostasis celular dan lugar a una pérdida en la integridad de la membrana de la mitocondria debido a una transición en la permeabilidad mitocondrial (174), que conlleva un desacople de la cadena respiratoria de forma incompatible con la supervivencia celular (175). Asimismo, durante los primeros minutos del daño por I/R se induce la formación de estrés oxidativo por la producción de ROS y nitrógeno a nivel de los complejos I y III de la cadena respiratoria mitocondrial, así como también por cambios post-transcripcionales en la enzima xantina oxidasa y la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa (176). Las principales moléculas afectadas por esta respuesta pro-oxidativa pertenecen a la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK/ERK), las quinasas c-Jun N- terminal (JNK) y la familia de proteínas quinasas B (Akt) (177). Otra proteína efectora modificada directamente por el daño oxidativo es la calcio-calmodulina kinasa II (CaMKII), contribuyendo a interferir con el proceso de manejo intracelular de calcio y agravando así su acumulación citosólica (176). A su vez, el daño mitocondrial producido por las ROS genera la liberación de patrones moleculares de daño celular (DAMPs), que establecen la activación del sistema de inmunidad innato mediante la vía del factor NF-kB y promueven la instauración de un proceso inflamatorio asociado (178, 179) a través de la infiltración leucocitaria 40 (mayoritariamente neutrófilos y macrófagos) que inducen el desacople de la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS) y disfunción endotelial, contribuyendo a exacerbar el daño celular y estrés oxidativo (180). La Figura 8 representa los cambios moleculares que tienen lugar durante el proceso de daño por I/R dentro de los cardiomiocitos. Figura 8. Mecanismos de daño por isquemia/reperfusión. Durante la reperfusión, se produce una rápida normalización del pH intracelular, que genera cambios iónicos a nivel celular mediados principalmente por la acumulación intracelular de calcio, con la formación de radicales libres y la inducción de una respuesta inmunitaria e inflamatoria, produciéndose la apertura del poro de transición mitocondrial con la subsiguiente activación del sistema de caspasas y los mecanismos de muerte celular por apoptosis/necrosis. Ca2+: Calcio; H+: Hidrógeno; K+: Potasio; mPTP: Poro de transición de permeabilidad mitocondrial; Na+: Sodio. Adaptado de (181, 182). Desde el punto de vista clínico, el daño por I/R puede presentar distintas manifestaciones. En primer lugar, es frecuente observar durante el período de reperfusión la aparición de inestabilidad eléctrica en la forma de arritmias ventriculares, que habitualmente se autolimitan espontáneamente y no requieren de un tratamiento específico (166). Por otro lado, el aturdimiento miocárdico es un proceso que se caracteriza por una afectación profunda en el metabolismo de los cardiomiocitos sobrevivientes, induciéndose cambios intracelulares que mantienen a las células en un estado latente, usualmente por días o semanas, hasta que se restauran definitivamente los mecanismos de homeostasis celular y recuperan su funcionalidad (183). En último lugar, la obstrucción microvascular se produce por la oclusión de vasos distales al evento coronario y puede ser agravado también por el fenómeno de daño por I/R, constituyendo uno de los parámetros más importantes predictores de morbi-mortalidad y pronóstico de la enfermedad (184). Esta obstrucción coronaria microvascular se ha estimado que sucede hasta en un 50% de los pacientes sometidos a ICP (185) y su etiología es multifactorial, comprendiendo la disfunción ISQUEMIA REPERFUSIÓN GLUCÓLISIS ANAERÓBICA H+LACTATOATP REDUCCIÓN DEL pH INTRACELULAR mPTP CERRADO mPTP ABIERTO H+ Na+ 2Na+ Ca2+ CARDIOMIOCITOS Na+ H+ Ca2+ 2Na2+ CONTRACCIÓN CONTRACCIÓN C IR C U LA C IÓ N C IR C U LA C IÓ N LAVADO DEL LACTATO NORMALIZACIÓN DEL pH INTRACELULAR MIOFIBRILLASMITOCONDRIAMITOCONDRIA MIOFIBRILLAS RETÍCULO ENDOPLÁSMICOCa2+ ORE CASPASAS CITOCROMO C HIPOXIA GLÓBULOS ROJOS GLÓBULOS ROJOS 41 endotelial, la micro-embolización de material en forma distal al sitio de la lesión, la microtrombosis coronaria y el daño capilar con atrapamiento neutrofílico (186). El fenómeno de no-reflow constituye la representación angiográfica de este fenómeno, y se manifiesta por una reducción del flujo anterógrado con restricción en la penetración de contraste hacia el tejido miocárdico (grado de perfusión o “blush”) observado durante la angiografía coronaria (187). Cabe remarcar que el daño oxidativo e inflamatorio desencadenado por la I/R no impacta únicamente en los cardiomiocitos, sino que también actúa a nivel de fibroblastos induciendo su transformación fenotípica a miofibroblastos, los cuales estimulan la producción de colágeno y el desarrollo de fibrosis intersticial, con la participación activa de metaloproteinasas de matriz (MMPs) que contribuyen a la degradación y remodelado de la matriz extracelular (188). 3.3.1. Metabolismo energético cardíaco y fenómeno de lipotoxicidad El corazón representa un órgano de alta demanda metabólica debido a su continua función contráctil, requiriendo en promedio 0.5 μmol/g/s de ATP, producido principalmente a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial. El 70% de la energía consumida por el tejido cardíaco proviene en condiciones fisiológicas del metabolismo de los ácidos grasos, aunque existen vías metabólicas accesorias derivadas del consumo de la glucosa (principalmente mediada por la proteína transportadora de glucosa de tipo 4 - GLUT-4), los cuerpos cetónicos y el lactato (189, 190). Los ácidos grasos pueden ser captados hacia el interior de los cardiomiocitos en forma pasiva, aunque predomina su transporte activo a través de una traslocasa (CD-36) y proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) (191). Una vez en el citosol, los ácidos grasos sufren una transformación mediada por la enzima carnitin-palmitoltransferasa I (CPT-1) hacia acil-carnitina de cadena larga, para luego atravesar la membrana mitocondrial. En el interior de esta organela, pueden ser nuevamente modificados a acil-CoA por la CTP-2 iniciando el proceso de b-oxidación para la síntesis de ATP, o ser esterificados y agrupados en forma de triglicéridos para su depósito dentro de los cardiomiocitos (192). A pesar de la alta dependencia del metabolismo energético cardíaco de la disponibilidad constante de ácidos grasos, los depósitos miocárdicos de triglicéridos resultan relativamente limitados. Esto es debido principalmente a la importante regulación existente en el contenido lipídico intra-miocárdico para evitar situaciones de lipotoxicidad (193), que consisten en fenómenos citotóxicos que tienen lugar al superarse la capacidad de oxidación de los ácidos grasos acumulados, provocando de esta forma su depósito intracelular al punto de interferir con la homeostasis normal de los cardiomiocitos. Esta 42 situación puede ser observada en casos de alteraciones metabólicas crónicas como en la insulino-resistencia, en la DM tipo 2 o en la obesidad, aunque se produce en mayor medida durante el proceso de daño por I/R (194). Asimismo, otro de los ácidos grasos esenciales relacionados con los fenómenos de lipotoxicidad es el diacil-glicerol (DAG). Éste puede transformarse en triglicéridos mediante la enzima DAG acil-transferasa (DGAT) contribuyendo así a exacerbar la concentración intracelular de triglicéridos. Este proceso de lipotoxicidad cardíaca estimula una respuesta pro-inflamatoria asociada (mediada por la activación de vías de señalización como el receptor simil-Toll 4 - TLR-4), con incremento del estrés oxidativo y disfunción mitocondrial, impactando directamente sobre la funcionamiento fisiológico de los cardiomiocitos y activando en última instancia los mecanismos de apoptosis celular (195, 196). La Figura 9 ilustra los mecanismos celulares mencionados que intervienen en el metabolismo energético celular cardíaco en condiciones fisiológicas y durante la isquemia celular. Figura 9. Metabolismo lipídico cardíaco en condiciones fisiológicas y fenómeno de lipotoxicidad por isquemia miocárdica. ACC: Acetil-CoA carboxilasa; AG: Ácidos grasos; AMP: Monofosfato de adenosina; AMPK: Protein-quinasa activada por AMP; ATGL: triglicérido lipasa adiposa; ATP: Adenosín trifosfato; BCAA: Aminoácido de cadena ramificada; CD: Clúster de diferenciación; CoA: Coenzima A; CPT: Carnitina palmitol-transferasa; DAG: Diacilglicerol; DGAT-1: Diacilglicerol O- aciltransferasa 1; FABP: Proteína de unión a ácidos grasos; FATP1: Proteína transportadora de ácidos grasos 1; G6P: Glucosa 6-fosfato; GLUT: Transportador de glucosa; HBP: Vía biosintética de hexosamina; HGL: Lipasa gástrica humana; HSL: Lipasa sensible a hormonas; IMS: Espacio inter- membrana mitocondrial; LPL: Lipoproteinlipasa; MAG: Monoacilglicerol; MCD: Malonil-CoA decarboxilasa; MPC: Transportador de piruvato mitocondrial; PCSK9: Proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9; PDH: Piruvato deshidrogenasa; PDK: Piruvato deshidrogenasa kinasa; PLIN5: Perilipina 5; PPP: Vía de fosfato de pentosa; TAG: Triglicéridos. Modificado de (192). TAG-AG LPL AG libres AG Membrana extracelular FATP1 FA B P AG Acil-transferasa Retículo endoplásmico TAG DAG AG Glicerol ATGL HSL HGL PLIN5 Lipólisis Ceramidas Acil-carnitina Acil-Coa de cadena larga saturada (palmitato) DAG AG-acilcarnitina CP T-1 CP T-2 AG-acetil-CoA β-oxidación Acetil-CoA Acetil-CoA AMPK Malonil-CoA ATP Mitocondria PPAR-ϒ MAG DGAT-1 Isquemia PCSK9 Isquemia Citosol ACSL-1 Lipotoxicidad Catecolaminas Lipólisis CD36 DAG AG-Acil-CoA ACC Partículas lipídicas 43 A nivel clínico, la esteatosis cardíaca se puede manifestar principalmente por alteraciones a nivel de la relajación y contractilidad miocárdica, que contribuyen al desarrollo de insuficiencia cardíaca, inducen cambios en la geometría ventricular y promueven un estado de sobrecarga de presión y volumen, condicionando la aparición de remodelado ventricular adverso y disfunción sistólica (191). 3.4. Remodelado ventricular adverso e insuficiencia cardíaca El remodelado cardíaco, descripto inicialmente a principios del siglo XX, involucra los mecanismos celulares y estructurales que se ponen en marcha en el marco del daño por I/R y progresan durante la formación de la cicatriz necrótica del infarto, induciendo modificaciones a nivel de la hemodinamia cardíaca y función ventricular (197). El remodelado ventricular adverso, definido como un incremento >20% en el volumen de fin de diástole del VI, constituye un predictor mayor independiente de eventos y mortalidad CV (198, 199). La IC, por su parte, es un síndrome clínico crónico que se ha convertido actualmente en una verdadera epidemia a nivel global (200). Afecta al 1-2% de la población mundial, aunque su prevalencia aumenta proporcionalmente con la edad alcanzando hasta el 10% en mayores de 70 años, y constituye la primera causa de hospitalización dentro de este segmento poblacional (201, 202). La enfermedad coronaria representa, a su vez, la principal causa etiológica de este síndrome, seguida por la cardiopatía valvular y diversas miocardiopatías. El crecimiento exponencial observado en la IC tiene como explicación un fenómeno dual: si bien, por un lado, un mayor número de personas consigue sobrevivir a un síndrome coronario agudo gracias a los avances en el tratamiento farmacológico y las terapias de reperfusión, una proporción cada vez más alta de pacientes lo hacen a expensas de diversos grados de disfunción ventricular residual, que predisponen al desarrollo del remodelado miocárdico adverso y posteriormente promueven la aparición de signos y síntomas de IC. De esta forma, la incidencia de esta patología se encuentra en franco ascenso, estimándose un aumento del 50% en los casos para los próximos 25 años, con una mortalidad calculada del 50% a 5 años (203, 204), superando ampliamente a la mayoría de cánceres y enfermedades crónicas. La IC se caracteriza por presentar distintos fenotipos, clasificados en base al nivel de alteración de la función sistólica del VI (FSVI), determinada a través de la medición de la fracción de eyección del VI (FEVI) (205): 44 § Insuficiencia cardíaca con FSVI reducida: FEVI£40% § Insuficiencia cardíaca con FSVI ligeramente reducida: FEVI entre 41-49% § Insuficiencia cardíaca con FSVI preservada: FEVI³50% Esta división en base a la FEVI proviene esencialmente del diseño clásico de los ensayos clínicos en IC que tomaron como parámetro principal a la FEVI, así como del beneficio secundario observado con terapias específicas definidas según el nivel de FEVI, y por lo tanto constituye un parámetro con importante capacidad pronóstico en pacientes con IC (205). A pesar de ello, el proceso fisiopatológico que tienen lugar durante el remodelado cardíaco se encuentra determinado por una compleja interacción de daño progresivo a nivel molecular, celular y últimamente estructural (206). La Figura 10 ilustra las principales características clínicas asociadas a la insuficiencia cardíaca según cada fenotipo de función ventricular. Figura 10. Fenotipos y características de la insuficiencia cardíaca según FSVI. Modificado de (207). 3.4.1. Mecanismos moleculares y celulares El remodelado ventricular se inicia en el momento del infarto y con la posterior necrosis de cardiomiocitos y el desarrollo de fibrosis intersticial, involucrando una serie de cambios que implican tanto al músculo cardíaco isquémico como el tejido no isquémico. Debido a la IC con FSVI reducida IC con FSVI ligeramente reducida IC con FSVI preservada ↑ ↑↑ ↑↑↑ ↓↓ ↓ ↑ ↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ ↑↑ ↑ ↑↑↑ ↑↑ ↑ ↑↑↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑↑ Fenotipos Edad Mujer Hipertensión arterial Fibrilación auricular Cardiopatía isquémica Péptidos natriuréticos Riesgo CV Riesgo no-CV 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% FEVI 45 muerte celular, se liberan una serie de factores moleculares como DAMPs, péptidos natriuréticos (tipo B, tipo pro-B amino-terminal y atrial) y troponinas, en forma proporcional al grado de afectación cardíaca, y por lo tanto constituyen marcadores tanto diagnósticos como pronósticos en pacientes con IAM e IC, predictores de hospitalización y mortalidad CV (208). Estas moléculas inducen la migración de (mio)fibroblastos cardíacos hacia el sitio de la lesión, que a través de la liberación de citoquinas pro-inflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), IL-1, IL-6 y quimioquinas (principalmente el ligando 2 de quimioquina, CCL2) establecen las formación de un proceso pro-inflamatorio a nivel del tejido dañado (209-211). A partir del tercer y cuarto día del IAM, se incrementa aún más el reclutamiento de células inflamatorias hacia el sitio del infarto (212), cuya actividad produce la degradación de la matriz extracelular de colágeno mediante la activación de metaloproteinasas y la re- expresión de genes fetales, lo cual induce alteraciones en la homeostasis celular, genera un adelgazamiento gradual de la pared ventricular, y posteriormente establece una progresiva dilatación del tejido isquémico-necrótico (165, 213). Asimismo, la migración de (mio)fibroblastos en conjunción con la activación de metaloproteinasas de matriz y colagenasas contribuirán a la formación de una escara necrótica y fibrótica para estabilizar el tejido dañado (206). La matriz extracelular se encuentra compuesta en un 95% por fibras de colágeno tipo I y tipo III, cuya función primordial consiste en brindar soporte y sostén al tejido celular y vascular, a la vez que regula funciones metabólicas y mantiene la distensibilidad cardíaca necesaria para su correcto funcionamiento (214). Durante el proceso de remodelado adverso, se genera una acumulación anormal especialmente de fibras de colágeno tipo I, inducidas por diversas vías de señalización incluyendo al factor de crecimiento transformante beta (TGF-b), angiotensina II, endotelina 1 y factores de crecimiento tisulares y plaquetarios. Estas fibras resultan más elongadas que las de tipo III alterando la relación existente entre ellas y provocando una desorganización de la citoarquitectura sarcomérica, lo cual conduce a una alteración en la relajación normal de cardiomiocitos, incrementando la rigidez miocárdica y el grado de disfunción diastólica (215). Los niveles de metaloproteinasas y colagenasas llegan a su pico alrededor del día 7 del IAM, siendo su actividad regulada estrictamente por inhibidores tisulares de metaloproteinasas (213). Diversos procesos adicionales tienen lugar durante el remodelado cardíaco, como un cambio en la expresión de isoformas de miosina de cadena pesada (a expensas de una reducción en las cadenas b y un aumento de cadenas a), un incremento de ciertos factores como el transportador de glucosa tipo 1 (GLUT-1), la galectina y la enzima convertidora de angiotensina (ACE), con una disminución concomitante en la enzima SERCA-2a, y una 46 modificación en el metabolismo energético virando de la b-oxidación de ácidos grasos hacia el consumo de glucosa (216, 217), como se ha comentado previamente, promoviendo la acumulación progresiva de triglicéridos a nivel miocárdico y exacerbando el fenómeno de lipotoxicidad cardíaca (218, 219). 3.4.2. Activación del sistema neuro-humoral Los mecanismos celulares y moleculares anteriormente descritos se encuentran estrechamente regulados por la activación del sistema neuro-endocrino. Las principales vías neuro-humorales relacionadas al proceso de remodelado ventricular e IC corresponden a la activación del sistema nervioso simpático (SNS) y el sistema renina- angiotensina-aldosterona (RAAS) (220). El primero de estos participa activamente desde los inicios del evento isquémico mediante la estimulación cardíaca b-adrenérgica y la liberación de noradrenalina, incrementando en forma temprana la frecuencia cardíaca y TA para mantener el trabajo sistólico en situaciones de reducción del volumen minuto (por deterioro del tejido contráctil). El RAAS, por su parte, se activa durante la primera semana del IAM a través de la inducción de angiotensina II (ATII), que interactúa con el receptor tipo 1 de ATII promoviendo daño citotóxico y aumentando el nivel de hipertrofia y fibrosis intersticial miocárdica (221, 222). A nivel renal, una acción directa de la angiotensina II y la aldosterona en el sistema tubular (la primera a nivel del túbulo proximal y la segunda a nivel distal), genera un aumento en la retención de agua y sodio para mantener la volemia y compensar el estado de reducción del gasto cardíaco, lo cual termina conduciendo en forma crónica hacia una situación de congestión sistémica y pulmonar (223). Una enzima intrínsicamente relacionada con la activación del RAAS es la neprilisina, una endopeptidasa dependiente de zinc que se encarga de degradar los péptidos natriuréticos liberados durante el estrés de cardiomiocitos (224). Estos péptidos, en conjunción con la adrenomedulina, son los encargados de equilibrar esta respuesta neuro-humoral al producir vasodilatación periférica, incrementar la diuresis y reducir el proceso de proliferación celular a nivel miocárdico (225). En el corto plazo, los mecanismos puestos en marcha en la IC buscan promover una serie de cambios a nivel cardíaco y sistémico cuya finalidad es sostener el gasto cardíaco para soportar las necesidades metabólicas del organismo. Sin embargo, su mantenimiento en forma crónica produce efectos deletéreos tanto a nivel miocárdico, vascular, como también un impacto en la función de múltiples órganos. Es por ello que la terapia farmacológica inhibitoria del sistema neuro-humoral se ha convertido en la piedra angular del tratamiento médico de la IC (223), y ha conseguido demostrar una reducción significativa de la 47 mortalidad, disminuyendo la aparición de eventos CV, ingresos hospitalarios, y mejorando la capacidad funcional y calidad de vida de estos pacientes (205). 3.5. Estrategias de cardioprotección En pacientes que sufren un evento CV isquémico, el daño acumulado generado tanto por la hipoxia celular así como el derivado de la I/R contribuye al compromiso final de infarto y últimamente de la función cardíaca global. (226). Por consiguiente, más allá de haberse conseguido obtener un descenso sustancial en las tasas de mortalidad tras un IAM secundario a la aplicación efectiva de las estrategias de reperfusión y tratamiento farmacológico combinado, el daño miocárdico residual continúa siendo sustancial, lo cual se traduce directamente en un incremento en la aparición de complicaciones CV y eventos clínicos (166). En este contexto, se han buscado desarrollar terapias novedosas destinadas a limitar el tamaño final del infarto y sus consecuencias, denominadas estrategias de cardioprotección. Estas estrategias pueden ser de tipo endógeno (condicionamiento isquémico) o de tipo exógeno (condicionamiento farmacológico) 3.5.1. Protección miocárdica endógena: condicionamiento isquémico El condicionamiento isquémico mecánico constituyó una de las primeras técnicas establecidas de cardioprotección, desarrollada inicialmente por Murray y colaboradores en 1986, quienes demostraron en un modelo canino de IAM alcanzar una reducción significativa del 75% en el tamaño final del infarto a través de la aplicación de ciclos repetitivos de isquemia y reperfusión en forma local, mediante la oclusión coronaria transitoria previa a la inducción propia del infarto (227). Las estrategias de cardioprotección mediante condicionamiento isquémico se basan en promover mecanismos de reparación endógenos e inhibir los procesos de daño cardíaco, para hacer frente tanto al evento isquémico en sí como al daño por I/R mediante la aplicación de procedimientos mecánicos intermitentes de isquemia y reperfusión en el marco del infarto. Durante las últimas 4 décadas, diversas terapias de condicionamiento isquémico han sido diseñadas con este fin, diferenciándose según su modalidad de acción y tiempo de aplicación, así como en los objetivos celulares y tisulares involucrados. Sin embargo, su proceso de traslación desde la investigación experimental hacia el campo clínico ha presentado considerables retos y continúa siendo una de las áreas de investigación CV más desafiantes en la actualidad. 48 Globalmente, las estrategias de condicionamiento isquémico pueden clasificarse en base a su tiempo de aplicación en (Figura 11) (228): § Pre-condicionamiento isquémico: el estímulo condicionante se administra previo al inicio del evento isquémico. § Per-condicionamiento isquémico: el estímulo condicionante se aplica durante el período de isquemia pero previo a la reperfusión. Post-condicionamiento isquémico: el estímulo condicionante es realizado posterior a la reperfusión. Figura 11. Fases temporales de aplicación del condicionamiento miocárdico en el daño por isquemia/reperfusión. Modificado de (229). Por su parte, de acuerdo al sitio de aplicación, el condicionamiento isquémico puede emplearse en forma local al lugar donde ocurre la isquemia, o utilizarse en forma remota a distancia de la misma en un órgano distinto al que sufre la isquemia. 3.5.1.1. Condicionamiento isquémico local Tras su descubrimiento, el pre-condicionamiento isquémico ha sido replicado en múltiples especies animales y humanos, así como en diversos órganos (230). Las bases Tiempo Muerte celular ISQUEMIA REPERFUSIÓN Cardioprotección Pre-condicionamiento Post-condicionamientoPer-condicionamiento 49 fisiopatológicas de este proceso no se encuentran completamente dilucidadas, pero involucran una actividad paracrina de los cardiomiocitos liberando factores bioactivos tras el estímulo condicionante, tales como bradiquinina, adenosina, acetilcolina, óxido nítrico, endotelina-1 y angiotensina 2 (231, 232). Estos mediadores actuarían a nivel mitocondrial a través de factores como la tirosin-quinasa, la protein-quinasa C, y principalmente activando las vías de señalización de la quinasa de salvamiento por injuria-reperfusión (RISK) y el factor activador de supervivencia (SAFE). Asimismo, éstos también inducen mediadores secundarios derivados de las vías de Erk1/2, Akt y el TNF-a, todo lo cual permite establecer un efecto cardioprotector inmediato y de corta duración (entre 2 a 3 horas) denominado primera ventana de cardioprotección (166). A continuación, tiene lugar una actividad más tardía que se produce entre las 12 a 24 horas del estímulo inicial conocida como segunda ventana de protección, caracterizada por la inducción de factores transcripcionales que presentan latencia en su activación y que permiten mantener esta respuesta en forma sostenida (hasta 72 horas), destacándose el factor inducible por hipoxia-1a (HIP-1a), JAK-STAT, proteínas de acción térmicas (HSP), la enzima NOS y el FN-kB (233). Esta técnica se ha aplicado tanto en protocolos asociados a cirugías de revascularización quirúrgica (mediante clampeo intermitente de la aorta durante el procedimiento) como también percutánea (por inflado alternante del balón intra-coronario) para reducir las consecuencias de los tiempos prolongados de isquemia y daño por reperfusión, trayendo aparejado una preservación en los niveles de ATP miocárdico y menor propensión a las arritmias ventriculares y disfunción sistólica (234, 235). Este proceso puede ser observado también en forma endógena, en aquellos pacientes que presentan episodios de dolor torácico anginoso por fenómenos de sub-oclusión coronaria transitoria previo al infarto, que resultan protectores frente al desarrollo posterior de isquemia reduciendo la aparición de complicaciones asociadas (236). Sin embargo, la mayor dificultad en el desarrollo del concepto de pre-condicionamiento reside en que los eventos isquémicos suelen ser fenómenos agudos y súbitos no predecibles, por lo que no es posible su aplicación en forma programada en la práctica clínica, a excepción de los procedimientos de revascularización (percutánea o quirúrgica) realizados en forma electiva, pero que suelen tener un impacto menor en términos de complicaciones isquémicas en comparación a los cuadros de síndrome coronario agudo. Para solventar dicho obstáculo, se desarrollaron en las últimas décadas protocolos de condicionamiento miocárdico tanto durante el propio período isquémico así como en forma posterior a la reperfusión del IAM, designándose como se ha visto antes per- y post- condicionamiento isquémico local, respectivamente. Estas técnicas evidenciaron, a nivel experimental, una reducción de hasta un 44% en el tamaño final del infarto, preservando 50 la función ventricular y limitando el grado de disfunción endotelial (237). De esta forma, sería posible su utilización en contexto de pacientes que presenten cuadros agudos o aquellos sometidos a revascularización en donde se observe evidencia activa de daño por I/R. Tanto el per- como el post- condicionamiento isquémico inducen cardioprotección a través de una disminución en el edema miocárdico, desarrollando una respuesta anti- inflamatoria y antioxidante (166), y utilizando vías fisiopatológicas similares a las activadas durante el pre-condicionamiento, liberando bradiquinina, adenosina, e induciendo la activación de protein-quinasas, SAFE y RISK (166). Este efecto ha sido probado en variados modelos animales como ratones, conejos, y cerdos, aunque experimentalmente ha obtenido globalmente resultados inferiores y más heterogéneos respecto al pre-condicionamiento isquémico (238, 239). A nivel clínico, si bien diversos meta-análisis demostraron una reducción significativa en el tamaño final del infarto con esta estrategia, con menor liberación de marcadores de daño miocárdico y una mejoría en la perfusión coronaria (valorada por angiografía, gammagrafía y resonancia magnética cardíaca) (240, 241), un estudio multicéntrico y randomizado que incluyó 700 pacientes sometidos a ICP no consiguió evidenciar efectos significativos en el grado de reperfusión coronaria (242). Estas diferencias podrían deberse nuevamente a la selección de pacientes, diseño de protocolos, así como a la presencia de diversos condicionantes clínicos que pudieran afectar los resultados obtenidos. La principal desventaja de esta técnica radica en que requiere emplear maniobras sucesivas a nivel local (clampeo aórtico en su variante quirúrgica o inflado de balón intra-coronario en forma percutánea), incrementando considerablemente el riesgo potencial de embolización distal y afectación de territorios vasculares adicionales, lo cual ha limitado efectivamente su empleo en la práctica clínica. 3.5.1.2. Condicionamiento isquémico remoto Por lo tanto, comenzaron a investigarse protocolos de isquemia transitoria de aplicación en forma remota en distintos órganos (a través de la oclusión de la arteria renal, mesentérica o femoral, entre otras) demostrando un efecto cardioprotector a nivel miocárdico al reducir el daño por I/R (243, 244). Los mecanismos celulares y moleculares responsables de esta actividad parecerían estar relacionados a su homólogo local (245), señalándose la participación tanto de factores humorales (termolábiles, hidrofóbicos y con peso molecular >3.5 kDa) así como de vías neuronales específicas (dado que la denervación anula parcialmente el efecto cardioprotector) (245-247). Posteriormente, el descubrimiento que la aplicación del condicionamiento remoto podría realizarse en forma no invasiva, mediante simplemente el inflado y desinflado de un 51 esfingomanómetro de medición de TA, permitió difundir su utilización en forma extendida y en múltiples escenarios clínicos, tanto en forma de pre- como post- condicionamiento, demostrándose una reducción en el grado del daño por I/R y disfunción cardíaca asociada (248-250). La mayor parte de los ensayos clínicos en humanos mediante condicionamiento isquémico remoto aplicados en cirugía cardiovascular e ICP evidenciaron un efecto cardioprotector a través de una reducción en el daño miocárdico peri-procedimiento, aunque estudios randomizados y controlados con mayor muestra poblacional, así como diversos meta- análisis subsecuentes encontraron resultados contrapuestos, sin hallarse impacto significativo a nivel de eventos CV mayores o mortalidad (251-254). De hecho, un reciente estudio combinando dos protocolos clínicos de condicionamiento isquémico remoto en contexto del ICP en más de 5.000 pacientes con IAMCEST no demostró diferencias significativas en torno a muerte CV u hospitalización por IC a 12 meses, y sin modificaciones en el tamaño del infarto evaluado mediante biomarcadores (255). Por lo tanto, la variabilidad en la evidencia observada así como un efecto cardioprotector limitado coartaron su aplicación en forma más generalizada. 3.5.2. Condicionamiento farmacológico Las estrategias farmacológicas de cardioprotección han sido evaluadas en forma paralela a las técnicas de condicionamiento isquémico, con variados resultados clínicos. El desarrollo de compuestos farmacológicos de condicionamiento se produjo históricamente a través de dos vías principales: por un lado, mediante el empleo de fármacos específicamente diseñados para contrarrestar los efectos deletéreos del daño por I/R; por otro lado, diversas drogas aprobadas y utilizadas para otra indicación clínica se emplearon con esta finalidad, dada la evidencia observada en ensayos controlados de un beneficio en cuanto a reducción de eventos cardiovasculares. La investigación en este campo se ha focalizado principalmente en los siguientes fármacos: § Péptido simil-glucagon tipo 1 (GLP-1): constituye una hormona incretina empleada como hipoglucemiante oral para el tratamiento de la DM tipo 2. Estos agonistas habían establecido su función cardioprotectora en estudios previos a gran escala en pacientes diabéticos de alto riesgo, evidenciando una reducción en los eventos CV, y posteriormente en estudios de prueba de concepto con una disminución en el tamaño del infarto y recuperación de la función ventricular (256, 257). Este factor ha demostrado producir cardioprotección a través de las activación de vías de señalización de RISK y SAFE (258). Sin embargo, resultados posteriores han 52 observado un efecto CV neutro, por lo que su indicación como cardioprotección actualmente es discutida (259, 260). § Adenosina: Un meta-análisis de 13 estudios randomizados y controlados evaluó la co-administración de adenosina en contexto del tratamiento de reperfusión en el IAMCEST, evidenciando un efecto beneficioso en términos de reducción de la incidencia de insuficiencia cardíaca post-isquémica y fenómeno de no-reflow (261). Su actividad cardioprotectora también se ha visto relacionada a una disminución tanto en el tamaño del infarto así como de eventos CV (262), aunque otros estudios han demostrado efectos neutros o discordantes (263, 264). Esta diferencia en resultados puede haberse debido a la amplia variabilidad de dosis empleadas, a la corta biodisponibilidad de acción de la adenosina, así como en los tiempos y vías de aplicación (siendo la intra-coronaria la más efectiva en los ensayos clínicos). § Beta-bloqueantes: Esta terapéutica ya indicada en pacientes con cardiopatía isquémica e IC ha demostrado adicionalmente una reducción en el tamaño final del infarto siendo administrados en forma temprana por vía intravenosa durante la reperfusión, mediante la modulación de la respuesta inflamatoria (principalmente neutrófilos). Sin embargo, los ensayos clínicos realizados hasta la fecha han evidenciado resultados discordantes posiblemente debidos a la diferencia de dosis empleadas y a los tiempos de administración utilizados (265, 266). § Ivabradina: Es un inhibidor selectivo de la corriente If del nodo sinusal regulando de esta manera la frecuencia cardíaca en pacientes con IC. En un modelo porcino de daño por I/R promovió una reducción significativa del tamaño del infarto, aunque investigada luego en humanos en forma de post-condicionamiento falló en establecer efectos significativos (267, 268). § Ciclosporina A: Es un fármaco que previene la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial, evitando las vías finales comunes de muerte celular programada en el daño por I/R. En forma similar a otras estrategias farmacológicas evaluadas, la ciclosporina A presentó resultados iniciales favorables en un número reducido de pacientes, que al ser extrapolados a ensayos clínicos en fase III no evidenció beneficios en reducir el tamaño del infarto o eventos CV (269-271). Esta ausencia de cardioprotección fue adjudicada en primera instancia a la formulación de la ciclosporina administrada (propiedades del vehículo), así como otras variables potencialmente confundidoras como tiempos de empleo y co-medicación. Otros 53 fármacos inhibidores de la apertura del poro de transición fueron evaluados en diversos escenarios clínicos pero sin resultados definitivos (272). 3.6. Nutracéuticos: potenciales estrategias de cardioprotección 3.6.1. Definición y usos En respuesta a la búsqueda de nuevas terapias con propiedades citoprotectoras que pudieran inducir cardioprotección en el contexto del daño por I/R, han cobrado relevancia una serie de productos medicinales con características híbridas entre nutrientes y “fármacos”, con demostradas propiedades beneficiosas a nivel metabólico y celular. Este grupo se refiere particularmente a los nutracéuticos, término designado por DeFelice en 1989 y que define a un alimento o fracciones del mismo que provee efectos positivos a nivel de la salud, en la forma de prevención o tratamiento de enfermedades (273, 274). No obstante, esto deriva de un concepto histórico más antiguo aún, formulado por Hipócrates en el año 400 d.C. a través de la frase: “Deja que el alimento sea tu medicina, y la medicina tu alimento” (275). Se calcula que actualmente entre el 50 al 70% de la población mundial consume algún derivado de nutracéuticos o suplemento dietario (276, 277), y el mercado global de nutracéuticos en 2021 fue de US$ 382 mil millones, estimándose que ese número se duplique en los próximos 5 años (278). El aumento exponencial en su uso deriva de una mayor adopción de hábitos de vida saludables, así como su empleo en las fases iniciales de diversas condiciones clínicas para evitar o diferir el uso de tratamiento farmacológico (277). Sin embargo, su regulación y legislación sigue siendo variable dependiendo de las distintas regiones, y no existe un término legal dentro de la Unión Europea para su definición (279). A pesar de su consumo en forma masiva, no se requieren estudios específicos que investiguen su seguridad, lo cual constituye un desafío a la hora de poder difundir su aplicación de forma más generalizada. Los nutracéuticos pueden ser catalogados en tradicionales o no tradicionales, según deriven de compuestos naturales o sean modificados en forma artificial, respectivamente (277), tal como se puede observar en la Figura 12. Dentro de los primeros se destacan los nutrientes (vitaminas, ácidos grasos poliinsaturados), productos herbáceos (tanto en forma natural como los fitoquímicos extraídos de plantas) y probióticos, es decir, cultivos bacterianos viables que optimizan las propiedades saludables de la flora bacteriana endógena (280). Dentro del segundo sub-grupo, se encuentran los nutracéuticos fortificados o recombinantes, aquellos en los que se adicionan artificialmente productos 54 beneficiosos para incrementar sus propiedades nutritivas mediante el empleo de diversas técnicas biotecnológicas (277). Figura 12. División de nutracéuticos según su origen y procesamiento. Asimismo, los nutracéuticos se clasifican fundamentalmente según su composición o estructura química, dado que es ésta quien le otorga sus propiedades terapéuticas diferenciales, y le imprime características farmacodinámicas y biodisponibilidad específicas (Tabla 1). NUTRACÉUTICOS Tradicionales Nutrientes Vitaminas Minerales Ácidos grasos poliinsaturadosProbióticos Fitoquímicos Naturales Bioingeniería No tradicionales Fortificados Recombinantes 55 Tabla 1. Clasificación química y principales propiedades terapéuticas de los nutracéuticos. 3.6.2. Nutracéuticos, enfermedad cardiovascular y potencial de cardioprotección A nivel cardiovascular, los nutracéuticos han sido evaluados tanto en monoterapia como en asociación al tratamiento farmacológico estándar, con el objetivo de limitar el impacto negativo de los factores de riesgo cardio-metabólicos y prevenir la aparición de eventos clínicos (principalmente cardiopatía isquémica e IC). Su efectividad en el tratamiento de los factores de riesgo CV ha sido analizada en numerosos ensayos controlados y PROPIEDADES TERAPÉUTICAS PROPUESTASCONSTITUYENTES QUÍMICOS Carotenoides Hipolipemiante, anti-oxidante, anti-tumoral.Licopeno Anti-oxidante.b-Caroteno Protección ocular frente a degeneración macular y cataratas.Luteína/xantofila Anti-oxidante, hipolipemiante, anti-tumoral.Tocotrienol Anti-tumoral, hipolipemiante.Saponinas Compuestos fenólicos Anti-oxidante, anti-tumoral.Flavononas Anti-oxidante, anti-tumoral.Flavonas Anti-oxidante.Flavonoles Anti-inflamatoria, anti-oxidante, anti-trombótica, anti-tumoral.Curcumina Anti-tumoral. Glucosinolatos Anti-oxidante.Taninos Fitoestrógenos Hipolipemiante, anti-oxidante, anti-tumoral.Isoflavonas Hipolipemiante, anti-oxidante, anti-tumoral.Lignanos Modulador metabólico, anti-inflamatorio, anti-oxidante.Flavonolignanos Fibras dietarias Protección del tracto digestivo, anti-tumoral, hipolipemiante.Fibras solubles Protección del tracto digestivo, anti-tumoral, hipolipemiante.Fibras Insolubles Inmuno-modulador.Sulfuros/Tioles Protección del tracto digestivo.Prebióticos Ácidos grasos Anti-inflamatorio, hipolipemiante, neuro-protector.Ácidos grasos Omega-3 Anti-inflamatorio, hipolipemiante.Ácidos grasos monoinsaturados Probióticos Protector del tracto digestivo, inmuno-modulador.Probióticos Minerales Modulan el metabolismo celular.Zinc, calcio, potasio, magnesio Alcaloides Anti-tumoral.Camptotecina Diurético, vasodilatador.Teobromina Anti-oxidante, anti-inflamatoria, neuro-protector.Berberina Terpenos Anti-inflamatorio, anti-tumoral, anti-microbiano.Mono-,di-,tri-,tetra-,poli-terpenos 56 randomizados, y a través de distintas revisiones y meta-análisis sobre el tema (281-295). Globalmente, han demostrado una tendencia favorable a promover un adecuado control de los factores de riesgo, aunque con algunos resultados neutros o discordantes, derivado de la elevada heterogeneidad presente entre los distintos estudios clínicos analizados. La principal evidencia clínica en cuanto a la actividad hipolipemiante de los nutracéuticos proviene principalmente de los fitoesteroles, la berberina y el arroz de levadura roja, promoviendo una reducción media de entre el 10-20% en los valores de colesterol total (296-302). Este efecto es mediado por una inhibición competitiva en la absorción intestinal de colesterol, asociada a una reducción en la secreción de moléculas de ApoB por los hepatocitos y una inducción en la expresión del receptor de LDL que promueve una mayor captación del C-LDL y reduce sus concentraciones plasmáticas (299-303). A nivel de su efecto sobre la HTA, los flavonoides, dentro del grupo de los polifenoles, han demostrado inducir una significativa vasodilatación arterial reduciendo los valores de HTA, y asociándose también una disminución significativa en los niveles de insulino-resistencia (304, 305). Por ello, dos meta-análisis posteriores han investigado la terapia con flavonoides para el tratamiento de la DM y la obesidad, demostrando una modulación en la homeostasis del metabolismo de la glucosa en conjunción con una reducción modesta en el índice de masa corporal (306, 307). Por el contrario, en cuanto a la evaluación directa del efecto cardioprotector de los nutracéuticos sobre la cardiopatía isquémica, la investigación de su efectividad para prevenir y limitar el avance tanto de la hipoxia celular así como del daño por I/R se ha restringido primordialmente a estudios en animales en los que sí ha demostrado beneficio, pero sin haberse conseguido una correcta traslación y extensión al campo clínico. Una importante cantidad de nutracéuticos de múltiples grupos químicos ha sido empleada para evaluar su capacidad de evitar o revertir los mecanismos de daño por I/R, no sólo limitado a nivel del sistema cardiovascular, sino también incluyendo otras condiciones clínicas variadas y órganos adicionales (308-310). No obstante, si bien el número de nutraceúticos valorados en este contexto ha sido extenso, sólo un grupo reducido y específico ha demostrado un efecto cardioprotector significativo. Dentro de los mecanismos postulados de cardioprotección por los nutracéuticos (Tabla 2), se ha observado que éstos actúan a nivel de múltiples vías de señalización celular, derivado principalmente de la presencia de varios grupos químicos en cada compuesto. Se ha descrito una inhibición de la vía del NF-kb regulada a través del gen BRCA1 (gen supresor de tumores relacionado con el cáncer de mama), así como una disminución en los niveles de mediadores inflamatorios como IL-1b, IL-6 y TNF-a, lo cual deriva en una importante actividad anti-inflamatoria, expandida adicionalmente por una supresión del 57 complejo inflamasoma NLRP3 (311, 312). A su vez, los nutracéuticos han demostrado ejercer propiedades citoprotectoras mediante una modulación de la fosforilación de las vías de PI3K/Akt/eNOS, junto a la proteína X asociada a Bcl-2 (Bax), y estimulando mTOR, que representa un quinasa ubicua involucrada en los mecanismos de proliferación y apoptosis celular, aunque su rol en el contexto del daño por I/R resulta controvertida (313- 315). También se les ha atribuido propiedades anti-oxidantes derivadas de la activación del factor de transcripción Nrf2 y la enzima hemo oxigenasa-1 (HO-1), así como la vía de SIRT-1 (sirtuína-1 deacetilasa dependiente de NAD) (316, 317). Asimismo, otra de las vías esenciales relacionada con la actividad de los nutracéuticos constituye la vía de señalización JAK-STAT. En este aspecto, cabe tener en cuenta que el daño por I/R activa rápidamente JAK1 y subsecuentemente JAK2, catalizando su fosforilación y permitiendo el acoplamiento del dominio SH2 de STAT, en donde STAT1 se ha visto promueve la apoptosis celular mientras que STAT3 induce protección de los cardiomiocitos isquémicos a través de su activación por IL-10 (318-320). Por su parte, una reducción en la fibrosis miocárdica y posterior remodelado ventricular ha sido evidenciada por la inhibición de AMPK, así como producto de la activación del factor inducible por hipoxia-1 alfa (HIF-1a) (315, 321). De la misma forma, algunos nutracéuticos inducen una actividad citoprotectora mediante la activación de ERK 1-2 y de la vía RISK, especialmente aquellos pertenecientes al grupo de fitoquímicos (322-324). 58 Tabla 2. Mecanismos moleculares de cardioprotección por nutracéuticos. Por su parte, dentro de los compuestos fenólicos, los flavonoides han sido evaluados en varios ensayos pre-clínicos dadas sus probadas propiedades anti-oxidantes y anti- inflamatorias. Los principales representantes han sido el resveratrol y el floroglucinol, evidenciando una importante actividad anti-aterosclerótica tanto en modelos de pequeños como grandes animales, demostrando a través de un análisis proteómico preservar la depleción de enzimas anti-oxidantes que ocurre durante la reperfusión, y consiguiendo así una reducción en la aparición de nuevos eventos isquémicos y una mayor supervivencia final (325-327). Los ácidos grasos pertenecen a otro grupo químico con efecto cardioprotector. Específicamente, los ácidos grasos Omega-3, que han demostrado reducir el área del infarto en un modelo murino de IAM a través de múltiples mecanismos, como su capacidad de optimizar la función endotelial, sus propiedades anti-inflamatorias, y su actividad como inhibidor plaquetar, todo lo cual también le confiere un efecto estabilizador de las placas de aterosclerosis (328-330). Sin embargo, un metaanálisis en pacientes con IAM no detectó efectos significativos a nivel de reducción de eventos clínicos o mortalidad CV (331). Anti-inflamatorio Inhibición NF-kb Supresión inflamasoma NLRP3 Reducción IL-1b Reducción IL-6 Reducción TNF-a Inhibición JAK/STAT Anti-apoptótico Inhibición ERK 1-2 Regulación PI3K/Akt/e-NOS Modulación mTOR Modulación BAX Activación STIM-1/ORAI 1-3 Activación RISK Modulación HIF-1a Anti-oxidante Activación Nrf2 Activación HO-1 Anti-fibrótico Activación AMPK 59 Otro de los ácidos grasos que ha tenido resultados positivos en ensayos pre-clínicos ha sido el ácido a-lipoico, gracias a sus propiedades anti-oxidantes e inhibitorias de la síntesis endógena de ROS. A su vez, el ácido a-lipoico se encuentra involucrado en el metabolismo energético cardíaco, permitiendo la oxidación de diversos cetoácidos dentro de los cardiomiocitos limitando el proceso de lipotoxicidad (332). Sin embargo, su efectividad en el ámbito clínico no ha sido valorada en profundidad. Por su parte, la carnitina, que representa un sustrato indispensable para la correcta transferencia de ácidos grasos a través de la membrana mitocondrial para su b-oxidación, ha sido administrada en diversos estudios en modelos murinos de daño por I/R, probando su efectividad al optimizar el metabolismo energético sometido a isquemia, mediante la estimulación del transporte de ácidos grasos acumulados dentro de los cardiomiocitos durante la reperfusión para su procesamiento, y disminuyendo así el daño oxidativo e inflamatorio derivado de la cardio-lipotoxicidad (333). No obstante, su traslación a ensayos con humanos nuevamente ha demostrado resultados discordantes. En un grupo de pacientes con cardiopatía isquémica sometidos a cirugía de revascularización miocárdica, la suplementación con este nutracéutico no redujo parámetros de remodelado ventricular adverso aunque sí se observó una mejoría estadísticamente significativa de la función sistólica del VI (334). Por otro lado, su administración en forma crónica a pacientes con diagnóstico de miocardiopatía dilatada e insuficiencia cardíaca avanzada se asoció con una mayor supervivencia del grupo tratado con un seguimiento a 3 años, aunque teniendo en cuenta que dicho estudio fue desarrollado previo a la adopción del tratamiento farmacológico moderno, lo cual podría influir en el impacto real obtenido (335). Asimismo, la suplementación crónica de diversos aminoácidos, y en particular la taurina, ha probado un efecto cardioprotector mediado por su inhibición del RAAS, evitando las consecuencias clínicas derivadas de su activación, y preservando la función mitocondrial en el daño por I/R, todo lo cual redundaría en una mejoría de la sobrevida celular (336, 337). Dentro del grupo de los minerales, los principales compuestos utilizados como terapia frente al daño por I/R han sido el zinc y el magnesio. Estos minerales participan activamente en numerosos procesos enzimáticos e intervienen directamente en la homeostasis celular. La administración de ambos minerales en forma de post-condicionamiento en modelos animales de cardiopatía isquémica ha demostrado reducir el área final del infarto y mejorar la recuperación de la función ventricular (338-340). Por último, la administración de la coenzima Q10 ha permitido limitar la disfunción endotelial asociada a los procesos de isquemia y reperfusión, optimizando la contractilidad miocárdica en modelos animales de IAM (341), y demostrando ser eficaz en reducir el daño por I/R a través de un incremento en la capacidad enzimática de las enzimas superóxido 60 dismutasa (SOD) y catalasa, para prevenir efectivamente el daño celular por estrés oxidativo (342). A nivel de la utilización de nutracéuticos en el tratamiento de la IC post-infarto, una revisión sistemática de 40 estudios evaluó su efectividad en forma complementaria a la terapia médica recomendada por guías de práctica clínica. La mayor evidencia provino principalmente de un único estudio, el Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Insufficienza cardiaca (GISSI-HF), randomizado, controlado y doble-ciego que evaluó en más de 7.000 pacientes el uso de ácidos grasos poli-insaturados en pacientes con IC en clase funcional II-III, demostrando una modesta pero significativa reducción de la mortalidad del 8% (IC 99%, 0,84-0,99) y de hospitalizaciones CV en un 7% (IC 99%, 0,87- 0,99) en todo el espectro de la función ventricular (aunque más del 90% poseían una FEVI<40%) (343). Sin embargo, otras revisiones sistemáticas del tema han evidenciado un efecto nulo con diversos nutracéuticos a nivel de aparición de eventos y mortalidad total (289). Esta variabilidad observada podría deberse a estudios con muestras muy limitadas de pacientes, con diseños metodológicos heterogéneos, y muchos de los cuales se habían implementado previo a la utilización del bloqueo neuro-humoral empleado en la actualidad (344). Una estrategia adicional de relevancia para mejorar la efectividad de la terapia con nutracéuticos en el ámbito de la protección cardiovascular consistió en administrar una suplementación combinada de estos compuestos, derivados de distintos grupos químicos. El objetivo final consistió en emplear diversos mecanismos de acción y dianas moleculares, para obtener un efecto aditivo producto de su asociación, teniendo una actividad sinérgica sobre diversos procesos enzimáticos, y de esta forma conseguir utilizar dosis menores de cada nutracéutico individual y limitar sus potenciales efectos adversos (283). En su mayor parte, para investigar su actividad cardioprotectora se emplearon una combinación de levadura de arroz rojo (con diversas concentraciones de monacolina K), junto a nutracéuticos del grupo de los compuestos fenólicos, fitoestrógenos, minerales, vitaminas, e incluyendo a también Silybum marianum (345-348). En estudios pre-clínicos y en humanos se evidenció una mayor actividad ateroprotectora, con reducción del daño endotelial y promoción de un efecto anti-inflamatorio, aunque sin traducirse esto en un impacto significativo sobre eventos CV mayores. Por otro lado, la quercetina, en asociación con diversos flavonoides, demostró un importante efecto de inhibición plaquetar, mediada a través de un incremento en la producción de óxido nítrico, disminuyendo el potencial oxidativo del peróxido de hidrógeno y superóxido, y estimulando una reducción en la producción de TXA2 derivada de la inhibición de la protein-quinasa C y Cox 2 (349, 350), tanto a nivel in vivo como in vitro (351, 352). 61 Esta tesis se ha centrado sobre dos nutracéuticos específicos que se desarrollan a continuación. 3.6.3. Espirulina La espirulina corresponde a un nutracéutico derivado de una microalga espiral miembro de las cianobacterias (353). Las principales especies en la actualidad corresponden a espirulina platensis, espirulina máxima y espirulina fusiforme. Constituye un nutracéutico con un elevado contenido proteico de alta calidad incluyendo a la mayoría de los aminoácidos esenciales, y es una fuente rica de minerales, vitaminas y anti-oxidantes (conteniendo ficocianinas, carotenoides, tocoferoles y compuestos fenólicos) (354). Adicionalmente, posee aproximadamente un 5% de ácidos grasos poli-insaturados, entre los que se encuentran el ácido linoleico, ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico (353, 355). La espirulina es considerada un nutracéutico seguro para el consumo humano con un perfil de bioseguridad favorable en diversos estudios pre-clínicos (355). En cuanto a su actividad metabólica, la espirulina ha demostrado múltiples efectos positivos. En pacientes obesos, evidenció un impacto significativo sobre el peso corporal, consiguiendo una reducción del índice de masa corporal y del perímetro de cintura (356, 357). Esta actividad podría estar mediada por una inhibición en la diferenciación adipocitaria, asociada a una disminución en la acumulación intra-hepática de lípidos y una modulación del centro cerebral del apetito promovida por la colecistoquinina, una hormona liberada por la acción de la fenilalanina, aminoácido presente en la composición química de la espirulina (358, 359). En tanto a su actividad sobre el tono vasomotor, la suplementación con espirulina en pacientes de riesgo CV elevado se acompañó de una disminución significativa en los valores de TA (360, 361). Uno de los principales componentes de la espirulina, la ficocianina, sería la responsable de este efecto al inducir un incremento en la función de la NOS endotelial y limitar directamente la funcionalidad de la enzima convertidora de angiotensina, bloqueando así la actividad del RAAS (362). De la misma forma, la espirulina ha sido evaluada para el tratamiento de la dislipemia en distintos ensayos clínicos, consiguiendo una significativa reducción en los niveles de colesterol total (entre un 10-33% dependiendo de la dosis empleada), C-LDL (15-45%) y triglicéridos (23-28%), con un incremento en los valores del colesterol de lipoproteínas de alta densidad (C-HDL) (del 11,5 al 15%) (355, 356, 360, 363). Sus mecanismos fisiopatológicos han sido investigados a nivel experimental, donde se ha demostrado una inhibición en la absorción yeyunal de colesterol y en la reabsorción del ácido biliar (364), aumentando la excreción lipídica fecal (365). A su vez, limita la función de la enzima 3- 62 hidroxi-3-metilglutaril-Coenzima A (HMG-CoA) reductasa e incrementa la actividad de la lipoprotein-lipasa (LPL), produciendo un efecto hipocolesterolémico al reducir el C-LDL y triglicéridos (366). Respecto al metabolismo de la glucosa, ensayos clínicos con espirulina en pacientes obesos y con DM tipo 2 han evidenciado una disminución en los niveles plasmáticos de glucosa y de la HbA1c (363). El mecanismo estaría relacionado en parte con el alto contenido proteico de espirulina, que reduciría la absorción intestinal de glúcidos, a la vez que estimula la secreción endógena de insulina pancreática (363). Sin embargo, de forma similar a lo observado con otros tipos de nutracéuticos, algunos estudios han presentado resultados disímiles, con un efecto neutro a nivel metabólico y sin demostrar un impacto significativo en los factores de riesgo investigados (360, 361). Por último, el efecto cardioprotector de la espirulina, y en especial sobre el daño por I/R, no ha sido prácticamente evaluado previamente. Su potencial efecto sobre el corazón se ha analizado únicamente en un modelo de cardiotoxicidad por doxorrubicina, tanto en animales pequeños (ratón) como in vitro en cardiomiocitos humanos, observándose una reducción significativa en los puntos finales de lipoperoxidación, IC y mortalidad (367, 368). A su vez, la espirulina ha demostrado efectos citoprotectores tanto en modelos animales como humanos y ha mejorado los parámetros de disfunción vascular y endotelial (369, 370). Esto es debido a su importante actividad antiinflamatoria y anti-oxidante, evidenciadas a través de un aumento en los niveles de IL-2 y reducción de IL-6, e induciendo la función de la enzima SOD (361, 371). La ficocianina, junto al b-caroteno, tendrían un papel principal en esta acción, reduciendo la presencia de ROS, la producción de nitritos y lipoperoxidación hepática, a la vez que inhiben la actividad de la enzima NOS inducible (iNOS), Cox-2, TNF-a y NF-kB (355, 372, 373), Por lo tanto, la espirulina constituiría un candidato nutracéutico de gran interés para evaluar su impacto en la prevención del daño por I/R en un modelo con adecuado potencial traslacional. 3.6.4. Silybum marianum La planta Silybum marianum, más comúnmente conocida como Cardo mariano, es un nutracéutico fitoquímico perteneciente a la familia Asteraceae, utilizada desde hace más de dos mil años para el tratamiento de diversas condiciones clínicas. Se encuentra compuesta por un conjunto de biomoléculas activas, de las cuales el 60 a 80% de ellas corresponden a flavonolignanos, fenoles naturales híbridos (parte flavonoide y parte lignano). Los flavonoides más abundantes corresponden a la silibinina A y silibinina B, que constituyen los componentes funcionales básicos de su principal compuesto, la silimarina 63 (374). El porcentaje restante se encuentra representado principalmente por ácidos grasos poliinsaturados (50% linoleico, 30% oleico) (375). Silybum marianum ha demostrado un adecuado perfil de seguridad, y se encuentra comercializada en forma de cápsulas en dosis variables. Su biodisponibilidad es baja y dependiente en gran medida de las sustancias complementarias utilizadas como vehículo del nutracéutico (376). Estudios iniciales pre-clínicos y posteriormente en humanos han evidenciado propiedades beneficiosas a nivel CV derivadas de su potente actividad anti-inflamatoria y anti-oxidante (377, 378). Estos efectos se encuentran mediados, por un lado, por sus propiedades inmunomoduladoras al inhibir la vía de las proteína cinasas activadas por mitógenos (MAPK) y el NF-kB, y por el otro, al inducir una importante capacidad anti-oxidante a través de distintos mecanismos complementarios: restituyendo la acción del factor nuclear 2 (376, 379), induciendo la activación de la SOD, así como una reducción en la peroxidación lipídica y una mayor quelación de metales pesados (380-383). Adicionalmente, Silybum marianum ha probado tener un impacto beneficioso sobre los principales factores de riesgo CV: consigue una disminución en los niveles plasmáticos de glucemia a través de un incremento en la insulino-sensibilidad y protección frente al daño de células-b pancreáticas; promueve la vasodilatación regulando los valores de TA; reduce la albuminuria previniendo el daño nefrótico; y modula el perfil lipídico disminuyendo el grado de esteatosis hepática (378, 384-387). Los mecanismos principales responsables de esta actividad metabólica corresponden a una reducción en los niveles de IL-1b y Cox-2, así como una disminución en la producción de colesterol mediada por una inhibición en la actividad de la enzima HMG-CoA reductasa, paso limitante en la síntesis endógena de colesterol (388-391). Por lo tanto, derivado de su importante actividad citoprotectora, Silybum marianum ha sido utilizada para el tratamiento de los procesos de daño por I/R a nivel de distintos órganos, con una adecuada efectividad global (382, 392-394). En este contexto, nuestro grupo ha demostrado previamente en un modelo con alto impacto traslacional (i.e., porcino) los beneficios cardioprotectores de Silybum marianum en el marco del IAM. Concretamente, se ha evidenciado por vez primera que la ingesta de Silybum marianum reduce el daño por I/R preservando la función mitocondrial e incrementando el tejido miocárdico viable post- infarto (395). Asimismo, se ha detectado una disminución significativa en la activación de las vías del factor de crecimiento transformante b1 (TGF-b1) y SMAD 2/3 (implicadas en la fibrosis miocárdica), e inhibición de las metaloproteinasas 2 y 9 (MMP-2/9). Todo ello se asoció finalmente a una mejoría en la función ventricular posterior a un IAMCEST (395). Sin embargo, aún queda por determinar un posible efecto protector sobre el remodelado ventricular adverso y sus consecuencias deletéreas. 64 3.7. Modelo animal de infarto agudo de miocardio El primer y principal desafío en la investigación traslacional lo representa la apropiada selección y establecimiento de un modelo animal acorde de enfermedad, que permita reproducir la fisiopatología humana de la forma más semejante posible, y considerando los tratamientos concomitantes y situaciones clínicas asociadas (396). Esto, a su vez, deberá establecerse dentro del marco de los estándares de experimentación animal, adecuándose a las recomendaciones de las guías ARRIVE y en respeto de las 3Rs desarrolladas en 1959 por Russell y Burch: reemplazo, refinamiento y reducción de animales en investigación (397, 398). Regularmente, es necesario encontrar un equilibrio entre el empleo de un modelo animal adecuadamente reproducible y al mismo tiempo costo-efectivo, que tenga la relevancia necesaria para su traslación a humanos. Sin embargo, la alta complejidad de la enfermedad aterotrombótica, así como la etiología multifactorial de la patología CV y en especial de los mecanismos de daño por I/R dificultan enormemente la instauración de un modelo animal conveniente. Del mismo modo, las diferencias inter-especies, la variabilidad en las técnicas y protocolos utilizados y la heterogeneidad en el diseño metodológico de los estudios pre-clínicos han contribuido aún más a limitar la traslación humana de los hallazgos experimentales. (399). 3.7.1. Características y potencial traslacional de modelos animales Los roedores habitualmente constituyen el modelo animal inicial para la fase exploratoria de la investigación pre-clínica. El uso de ratas y ratones se ve favorecido por el amplio conocimiento de su información genética, la posibilidad de introducir modificaciones particulares en genes, su corto período de gestación y los bajos costos asociados a su mantenimiento (396). Por su parte, los conejos constituyen animales de transición entre pequeños modelos a grandes animales, debido a que su relativo tamaño permite la realización más definida de IAM quirúrgicos, a la vez que presentan una funcionalidad electrofisiológica semejante a los humanos (400). Sin embargo, el sistema cardiovascular global de estos modelos dista en gran medida de la condición humana. De los modelos animales de ECV empleados en la actualidad, el modelo porcino ha sido establecido por la comunidad científica internacional como el más relevante y representativo en investigación pre-clínica y traslacional (401), debido a las múltiples características que lo definen. Por un lado, tanto la anatomía coronaria, el tamaño de los vasos sanguíneos, y la estructura y función cardíacas se correlacionan apropiadamente a su homólogo humano (402). A diferencia del modelo canino, los cerdos exhiben dominancia 65 coronaria derecha en forma similar a humanos, con una clara separación entre los diferentes territorios coronarios, lo cual permite la inducción de infartos precisos y bien localizados dada la escasez de circulación colateral que sí se encuentra presente en perros (403, 404). Adicionalmente, la oclusión experimental de una arteria coronaria en cerdos induce un IAM en forma análoga a los territorios afectados en humanos y con un proceso de remodelado ventricular adverso comparable (401). En este sentido, la principal más frecuentemente intervenida en los modelos de cardiopatía isquémica corresponde a la arteria coronaria izquierda, especialmente ambas ramas principales correspondientes a la arteria circunfleja y descendente anterior. La afectación de la primera permite generar infartos más pequeños y localizados en la pared lateral del ventrículo izquierdo, lo cual reduce considerablemente la aparición de complicaciones y mortalidad intra-procedimiento y presenta un menor impacto a nivel de la disfunción cardíaca. Por el contrario, la oclusión de la arteria descendente anterior produce infartos antero-apicales y septales con mayor compromiso de tejido miocárdico dañado, lo cual redunda en un aumento de las eventos arrítmicos e IC aguda durante la intervención, y produce un deterioro más importante de la función ventricular (401). Si bien esto implica una mayor tasa de mortalidad inmediata o en el corto plazo, genera zonas de infarto más significativas y a la vez severas que resultan fundamentales para evaluar adecuadamente la eficacia de las estrategias terapéuticas investigadas, ya que impactos menores en la función y remodelado tendrían menor potencia para demostrar la efectividad de una nueva terapia en estudio. Asimismo, el modelo porcino presenta una alta tasa de supervivencia (>70%) con técnicas percutáneas y protocolos de intervención modernos, permitiendo la inducción de un infarto graduable según la necesidad, dependiendo del sitio de oclusión coronaria y el tiempo relativo de isquemia (405). 3.7.2. Modelo porcino de infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST En consecuencia, el modelo porcino de IAM representa el estándar en investigación animal traslacional, y puede ser establecido a través de la oclusión coronaria tanto en forma quirúrgica como percutánea. Los modelos quirúrgicos implican la realización de toracotomía mediana y ligadura coronaria directa. Sus ventajas radican en asegurar una visualización amplia y abierta del territorio estudiado así como la posibilidad de evaluar directamente la función contráctil cardíaca durante el procedimiento, aunque en contraparte presentan una más elevada mortalidad peri-intervención, con mayor tasa de complicaciones asociadas (inflamación, infecciones, sangrado) así como un importante 66 daño muscular y tisular residual (derivado de la apertura mecánica de tórax) que puede desencadenar una respuesta inflamatoria adicional al del propio evento isquémico. Para solventar dichas dificultades, el modelo percutáneo de IAM ha sido desarrollado, habiéndose observado un incremento sustancial en su utilización en forma paralela al empleo más generalizado de la ICP en humanos. Inicialmente, distintas estrategias percutáneas fueron empleadas para el establecimiento del proceso isquémico, como la ablación alcohólica intra-coronaria o intra-miocárdica (406, 407), la inyección de distintos materiales (gel de agarosa, mezclas de trombina/fibrinógeno, esponjas de espuma y microesferas) (408-411) o la administración de sustancias trombogénicas para inducir trombosis intracoronaria in situ (412). Sin embargo, todas estas estrategias se acompañaban de varias complicaciones que limitaban su aplicabilidad. Tanto la embolización con alcohol como la utilización de sustancias químicas producían una clase de infarto que no reproducía íntegramente al que se hubiese generado por oclusión de la circulación coronaria nativa, a la vez que dichas sustancias podían refluir hacia otros territorios impidiendo delimitar adecuadamente el sitio concreto del infarto. Posteriormente, se implementó el inflado de balón intra-coronario para la obstrucción transitoria del flujo sanguíneo, lo cual permitió demarcar con detalle el sitio de oclusión propuesto así como el territorio afectado, sin las complicaciones derivadas de la cirugía cardíaca. Este método no sólo incrementó la fiabilidad de los datos obtenidos sino que además permitió un seguimiento a mediano/largo plazo, algo que con los métodos quirúrgicos resultaba menos viable (413). Los estudios realizados en nuestro grupo y en otros han evidenciado que la oclusión con balón intra-coronario a nivel proximal de la arteria descendente anterior en conjunción a un tiempo de isquemia más prolongado (90 minutos) se asoció con un mayor tamaño final del infarto (414), equivalente a hasta un 75% del total del corazón isquémico en riesgo (415, 416). 67 4. HIPÓTESIS La cardiopatía isquémica representa la primera causa de mortalidad en el mundo, con un considerable impacto en la calidad de vida y pronóstico de los pacientes que la padecen, y una elevada carga económica y social para los sistemas de salud. En el último tiempo ha quedado en relevancia que un amplio número de pacientes que sufren un IAMCEST (oclusión coronaria completa), pese a recibir una terapia de reperfusión efectiva de forma temprana, presentan áreas de infarto de gran tamaño que contribuyen al desarrollo posterior de un remodelado ventricular adverso y progresan en etapas subsiguientes a diversos grados de disfunción ventricular e insuficiencia cardíaca. De hecho, el tamaño final del infarto es uno de los principales determinantes del pronóstico global de esta patología. A pesar de los intensos esfuerzos destinados a la búsqueda de estrategias terapéuticas capaces de mitigar las consecuencias deletéreas derivadas tanto del propio infarto en sí, así como del daño establecido por el proceso de isquemia/reperfusión, actualmente no existen terapias de cardioprotección que se implementen a nivel clínico lo que refuerza la necesidad de buscar posibles estrategias o nuevos compuestos capaces de proteger el corazón infartado. Los nutracéuticos corresponden a un grupo de compuestos bioactivos de origen natural, que además de ser ricos en determinados nutrientes poseen comprobados beneficios para la salud cardiovascular al ejercer potentes efectos anti-inflamatorios y antioxidantes, favoreciendo la supervivencia celular y modulando positivamente diversos estados metabólicos. Sin embargo, su utilidad y efectividad como potenciales agentes cardioprotectores en el marco de un IAMCEST queda aún por ser investigado. En base a lo anteriormente expuesto, nuestra hipótesis de trabajo es la siguiente: La ingesta regular de espirulina y Silybum marianum (nutracéuticos) ejercerá efectos cardioprotectores directos que limitarán el daño estructural y funcional desencadenados en el marco de un IAMCEST. 68 5. OBJETIVOS Esta hipótesis se abordará con los siguientes dos objetivos: 5.1. Objetivo 1 Estudios previos han evidenciado que la espirulina produce efectos anti-ateroscleróticos y reduce la cardiotoxicidad inducida por el tratamiento quimioterápico con antraciclinas (doxorrubicina). Sin embargo, el potencial de la espirulina para limitar el daño miocárdico y mejorar la disfunción ventricular en el contexto del infarto agudo de miocardio (daño por I/R) aún no ha sido determinado. En base a estas observaciones, y teniendo en cuenta las propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y citoprotectoras de este nutracéutico, en nuestro primer objetivo investigamos si la suplementación oral diaria con espirulina reduce el tamaño de infarto y mejora la función cardíaca post-IAMCEST. 5.2. Objetivo 2 Hemos demostrado previamente que la ingesta de Silybum marianum (Cardo mariano) durante 10 días previa inducción de un IAMCEST limita el tamaño de infarto y mejora la contractibilidad cardíaca. Estos beneficios se asociaron, a nivel molecular y celular, con un menor estrés oxidativo, una preservación de la función mitocondrial y una mayor supervivencia del miocardio dañado (336). Asimismo, también hemos descrito, en el marco del IAMCEST, que la revascularización del miocardio isquémico induce la acumulación de triglicéridos a nivel cardíaco (cardiolipotoxicidad), lo cual favorece el remodelado ventricular adverso post-infarto (376). En base a esta evidencia, y teniendo en cuenta las propiedades metabólicas beneficiosas atribuidas a Silybum marianum, en nuestro segundo objetivo analizamos si la ingesta regular de este nutracéutico previene de los efectos deletéreos asociados a la cardiolipotoxicidad post-infarto contribuyendo así a atenuar el remodelado ventricular adverso y preservar la función miocárdica. Ambos objetivos se llevaron a cabo utilizando un modelo porcino altamente traslacional mediante la inducción percutánea transcatéter de un IAMCEST, en el que se combinaron 69 la evaluación de parámetros cardíacos estructurales y funcionales, estudios moleculares en distintos tejidos junto a análisis hematológicos y bioquímicos. 70 6. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS Los materiales y métodos utilizados se encuentran detallados en los artículos publicados como parte del proyecto de esta tesis doctoral. El artículo 1 concierne la investigación relacionada al objetivo 1 de estudio, mientras que el artículo 2 desarrolla la hipótesis correspondiente al objetivo 2. § Artículo 1: Vilahur G*, Sutelman P*, Ben-Aicha S, Mendieta G, Radiké M, Schoch L, Casaní L, Borrell- Pagés M, Padro T, Badimon L. * both authors contributed equally Supplementation With Spirulina Reduces Infarct Size and Ameliorates Cardiac Function in a Pig Model of STEMI. Frontiers in Pharmacology. 2022 May 3; 13: 891801. DOI: 10.3389/fphar.2022.891801. § Artículo 2: Vilahur G, Sutelman P, Mendieta G, Ben-Aicha S, Borrell-Pages M, Peña E, Crespo J, Casaní L, Badimon L. Triglyceride-induced cardiac lipotoxicity is mitigated by Silybum marianum. Atherosclerosis. 2021 May; 324: 91-101. DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2021.03.014. 71 6.1. Artículo 1 La espirulina constituye un nutracéutico con propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y citoprotectoras. El presente trabajo investigó si la administración de espirulina induce un efecto cardioprotector en un modelo porcino de IAMCEST. Con esa finalidad, dicho nutracéutico fue administrado por un período de 10 días, y posteriormente se llevó a cabo la inducción de un IAMCEST mediante oclusión coronaria percutánea por 1,5 horas seguido de un período de 2,5 horas de reperfusión. La espirulina demostró ejercer efectos protectores frente al daño por I/R que se asociaron a una reducción significativa en el tamaño final del infarto y una mejora en la función ventricular. 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 6.1.1. Material suplementario 86 87 6.2. Artículo 2 Hemos demostrado en el modelo porcino de IAMCEST el potencial de Silybum marianum de reducir el tamaño de infarto de manera aguda tras el evento. En este segundo estudio evaluamos el potencial de Silybum marianum de limitar el remodelado ventricular adverso que se desencadena tras inducir un IAMCEST. La administración oral de Silybum marianum redujo de manera significativa y temprana la absorción intestinal de triglicéridos con la consiguiente reducción en sus niveles plasmáticos. Tras 3 semanas de ingesta post- IAMCEST se observó una atenuación significativa del remodelado ventricular adverso y una mejora en la función ventricular que se asoció con una menor acumulación de triglicéridos en el miocardio infartado (i.e., cardiolipotoxicidad) y un aumento en los receptores encargados de la eliminación lipídica a nivel cardíaco. 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 6.2.1. Material suplementario 100 101 102 103 Supplemental Figure 1. Experimental design. Study 1: effect of daily intake of Silybum Marianum (SM) for 10 days on lipid levels, lipid characterization and analyses of potential side-effects. Study 2: administration of SM 2 hours prior to ischemia (myocardial infarction; MI-induction) and its effects on myocardial lipid infiltration and glycoprotein P expression shortly after reperfusion (2.5 h) or after a 3-week period. STUDY 1 STUDY 2 10 days Outcome Treatment control q.d. Lipid characterization, molecular analysis of lipid receptors and glycoprotein P Treatment SM (15 mg/kg) q.d. Small intestine Liver Myocardium Lipid characterization, molecular analyses of lipid receptors, glycoprotein P, and PPARγ (3weeks). Myocardium Side effects of SM Healthy (non-infarcted) myocardium Lipid profile Kidney and liver 10 days MI induction (1.5h ischemia) Reperfusion 2.5 h 3 weeks Post-MI control (n=6) q.d. Post-MI SM (15 mg/kg/day; n=6) q.d. Pre-treatment control (n=12) q.d. Pre-treatment SM (15 mg/kg; n=12) q.d. 0 15 30 45 60 LV anterior wall LV posterior wall LRP1 0 1 2 3 LV anterior wall LV posterior wall 0 1 2 3 LV anterior wall LV posterior wall VLDLR 0 1 2 3 LV anterior wall LV posterior wall LRP5 Supplemental Figure 2. Effect of Silybum Marianum (SM) on myocardial lipid characterization (A) and expression of myocardial lipid receptors and glycoprotein-P (B) in non-infarcted hearts (not subjected to myocardial infarction but supplemented for 10 days with Silybum Marianum (SM) or control animals). LV: left ventricle; CE: cholesteryl esters; TG: triglycerides; FC: free choleserol; LRP: lipoprotein receptor-related protein; VLDL-R: very low density lipoprotein receptor. N=6 animals/group. A. B. µg /m g pr ot ei n CE TG FC Pr ot ei n ex pr es sio n LRP1 β-actin Pr ot ei n ex pr es sio n Pr ot ei n ex pr es sio n Healthy control (w/o MI-induction) Healthy SM (w/o MI-induction) Pr ot ei n ex pr es sio n LRP5 β-actin VLDLR β-actin Glyc-P β-actin Pr ot ei n ex pr es sio n CD 36 CD36 β-actin 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 LV Anterior wall LV Free wall LV Anterior wall LV Free wall Healthy control Healthy SM 0 1 2 3 LV anterior wall LV posterior wall CD36 LRP1 LRP5 VLDLR Glycoprotein-P 104 Supplemental Figure 3. Liver lipid characterization. Neutral lipid content 10 days after SM supplementation in healthy animals (A), lipid-receptors gene (B) and protein (C) expression, and HIF1-alpha protein expression (D). CE: cholesteryl esters; TG: triglycerides; FC: free cholesterol; LRP: lipoprotein receptor- related protein; VLDL-R: very low density lipoprotein receptor; HIF: Hypoxia-inducible factor. *p<0.05 vs Control; Black squares: control; White Squares : SM. µ, g/ m g pr ot ei n CE TG FC CE TG FC Control SM Liver A. LR P1 /1 8S rR N A LR P5 /1 8S rR N A G ly co pr ot ei n P/ 18 Sr RN A * * * V LD L- R/ 18 Sr RN A * B. LR P1 (A U ) LR P5 (A U ) V LD L- R (A U ) LRP1 LRP5 Control SM VLDL Glyc-P β-actin C. 0 20 40 60 80 100 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Control SM G ly co pr ot ei n P (A U ) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Control SM Control SM 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Control SM 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Control SM 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Control SM 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Control SM 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Control SM H IF 1- al ph a (A U ) HIF1-α 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Control SM 0 1 2 Control SM VLDLRLRP5LRP1 Glycoprotein P HIF-1α VLDLRLRP5LRP1 Glycoprotein P D. Control SM 105 7. DISCUSIÓN El objetivo central de esta tesis consistió en investigar e identificar nuevas terapias de cardioprotección que limiten el daño miocárdico desencadenado tras un IAM y permitan desarrollar respuestas citoprotectoras para favorecer la recuperación estructural y funcional de los tejidos involucrados. Para dicha tarea se plantearon dos objetivos principales que consistieron en evaluar la actividad de dos nutracéuticos específicamente seleccionados, a través del desarrollo de sendos trabajos de investigación en forma independiente pero inter-relacionada, mediante el empleo de protocolos de estudio, vías y tiempos de administración semejantes así como la utilización de un modelo animal consistente. 7.1. Cardioprotección mediante condicionamiento miocárdico El condicionamiento miocárdico en sus diversos tiempos (previo al daño celular, durante el mismo o posterior) y formas (mecánico o farmacológico, remoto o a distancia) ha resultado una herramienta efectiva y fácilmente adaptable a las variables situaciones clínicas a las que fue empleado, logrando una aplicabilidad y reproducibilidad considerable. Particularmente en la patología cardiovascular de etiología aterotrombótica, su forma de presentación súbita supone la necesidad de contar con terapias que se encuentren rápidamente disponibles y puedan ser empleadas con efectividad una vez acaecido el evento isquémico, o luego de haberse instaurado los tratamientos de reperfusión correspondientes. En ese contexto, el condicionamiento farmacológico resulta la estrategia más conveniente al utilizar compuestos que puedan estar disponibles en cualquier ámbito y que no dependan del uso de herramientas mecánicas en ciclos repetitivos que podrían no ser aplicables en todos los escenarios clínicos. Para tal fin, resulta esencial seleccionar adecuadamente los compuestos químicos, siendo de elección aquellos que no requiriesen de una preparación sustancial antes de ser utilizados, pudiendo ser almacenados en su forma activa y administrados al momento de ser necesarios. 7.2. Nutracéuticos como vehículos terapéuticos Los nutracéuticos representan un conjunto de macromoléculas presentes naturalmente en su mayoría en formas biológicamente activas, capaces de ser formulados en preparaciones relativamente sencillas de desarrollar, guardar y distribuir. De esta forma, han sido 106 postulados a través de las últimas décadas como potenciales candidatos para contrarrestar los efetos deletéreos de numerosas condiciones. Debido a los múltiples grupos químicos presentes en su composición, demuestran una gran variedad de funciones y actividades muy diferenciadas, habiéndose demostrado considerables propiedades moduladoras y citoprotectoras. Sin embargo, dada su utilización sistemática en ensayos no metodológicamente comparables, no se ha conseguido hasta la actualidad avanzar en el desarrollo de estudio que demuestren un efecto consistente y sostenido en humanos. El diseño de tesis doctoral ha buscado mitigar estas disparidades observadas históricamente en el empleo de nutracéuticas como armas terapéuticas. Por un lado, se han seleccionado nutracéuticos que contengan más de un grupo químico en su composición, lo que permitiría hacer uso de varios mecanismos de acción simultáneos y coadyuvantes para potenciar su efecto local y sistémico. Asimismo, se han elaborado protocolos de investigación pre-clínicos comparables y reproducibles que permitan evitar la aparición de sesgos y factores confundidores, reduciendo así la marcada heterogeneidad presente hasta el momento. Finalmente, la utilización de modelos animales más cercanos a la anatomía y fisiopatología humanas lograrían obtener resultados más directamente extrapolables capaces de ser validables en cohortes humanas, por lo que se ha seleccionado al modelo porcino para investigar las propiedades terapéuticas de la espirulina y el Silybum marianum en el IAM. 7.3. Modulación metabólica de espirulina y Silybum marianum Los efectos beneficiosos de la espirulina sobre los factores de riesgo CV han sido descriptos previamente. En este trabajo, hemos observado que la suplementación con espirulina no indujo cambios sustanciales en el perfil lipídico o glucémico de los animales tratados, pero sí trajo aparejada una disminución significativa en la tasa de incremento de peso en comparación a controles. Es importante tener presente que existe evidencia conflictiva respecto al efecto metabólico real de la espirulina, específicamente sobre los valores de colesterol y glucemia, lo cual podría deberse como se ha mencionado a la extensa heterogeneidad presente en los protocolos de estudios tanto a nivel básico como clínico, con una importante variabilidad en el tiempo de tratamiento, dosis empleadas y momento de aplicación, confluyendo así en una escasez de resultados consistentes y extrapolables. En cuanto a la modulación del peso corporal, su efecto se postula estaría mediado por una inhibición directa de la actividad de la lipasa, y a través de un bloqueo en los mecanismos neurológicos relacionados al centro cerebral del apetito (358, 359, 417). Un metaanálisis 107 reciente demostró que el consumo regular de espirulina produjo una reducción significativa en el peso corporal total, sin haberse constatado que sea producto de una disminución asociada en el consumo calórico (418). Adicionalmente, se observó que la suplementación con espirulina promovió cambios beneficiosos sinérgicos en la microbiota intestinal (419, 420), reduciendo el efecto negativo de las dietas hipercolesterolémicas en los animales suplementados y ejerciendo efectos anti-inflamatorios tanto a nivel intestinal como sistémico. Se requerirá de un mayor número de estudios en el tema con diseño metodológicos comparables para identificar adecuadamente el tiempo necesario de utilización así como la dosis de espirulina a administrar. Por su parte, la administración crónica de Silybum marianum ha demostrado inducir un significativo efecto hipolipemiante a nivel sistémico derivado de una reducción en la absorción intestinal de colesterol, mediada principalmente por su efecto a nivel del metabolismo de los triglicéridos. Esta actividad se ha traducido en un impacto directo sobre el miocardio isquémico en el curso de un IAM, reduciendo la infiltración lipídica y la toxicidad derivada de la misma. De la misma forma observada con el empleo de espirulina, la evidencia relacionada a los efectos de Silybum marianum sobre los factores de riesgo cardiovascular es abundante con un resultado neto a favor de su modulación lipídica, pero con resultados disímiles que no permiten validar adecuadamente su efectividad. 7.4. Cardioprotección mediante condicionamiento por espirulina y Silybum marianum El primer artículo de esta tesis evidenció que la suplementación dietaria con espirulina durante 10 días promueve un efecto cardioprotector frente a un evento isquémico agudo por oclusión coronaria completa (IAMCEST), que se asocia a una reducción en el tamaño final del infarto y una mejoría en la función ventricular. Por primera vez, hemos demostrado el efecto cardioprotector de espirulina para reducir el daño por I/R secundario a un IAMCEST. La actividad cardioprotectora de espirulina se estableció en base a la inhibición de mecanismos inflamatorios, oxidativos y de muerte celular por apoptosis que constituyen la base fisiopatológica esencial del daño por I/R que se desencadena tras un IAM. En nuestro estudio, hemos señalado los efectos directos de la acción de espirulina a nivel cardíaco al detectar una reducción del 64% en el tamaño final del infarto y un incremento del 30% en la función sistólica del VI en comparación a controles sometidos al mismo evento isquémico. 108 Como se ha mencionado anteriormente, los estudios más cercanos a evaluar los efectos de cardioprotección por espirulina han sido en base a un modelo animal de cardiotoxicidad por la administración de doxorrubicina, un agente quimioterápico familia de las antraciclinas empleado en el tratamiento de diversas neoplasias, que genera una inhibición de la enzima topoisomerasa II impidiendo la síntesis normal del ADN y presenta un efecto cardiotóxico directo a nivel miocárdico. La espirulina fue evaluada tanto en cardiomiocitos de rata como de humanos, así como en un modelo murino, bajo un protocolo de administración de espirulina los 3 días previos a la terapia con doxorrubicina y por 7 semanas posteriormente (367, 421). El tratamiento con espirulina provocó una marcada atenuación de la respuesta oxidativa, con una reducción del daño al ADN, limitando la liberación del citocromo c mitocondrial y disminuyendo la actividad de caspasas, redundando en una menor tasa de apoptosis de cardiomiocitos. A nivel clínico, esto se tradujo en una reducción significativa del riesgo de desarrollar IC así como en la mortalidad CV. Notoriamente, este efecto protector de la espirulina no fue contrabalanceado por una menor actividad anti-tumoral de la doxorrubicina, que mantuvo intacta su efectividad clínica. En nuestro estudio, hemos expandido esta evidencia al demostrar los mecanismos responsables de la actividad cardioprotectora de espirulina en el contexto de un IAMCEST, asociándose a una reducción significativa en el daño oxidativo relacionado al ADN, y a una modulación de la actividad pro-inflamatoria con una menor expresión miocárdica de MCP- 1. Estos efectos anti-oxidante y anti-inflamatorio observados tras el tratamiento con espirulina podrían haber contribuido a la menor expresión de caspasa-3 detectada en tejido miocárdico isquémico, un claro indicador de reducción de muerte celular por apoptosis, promoviendo así una mayor preservación de miocardio viable post-IAM. Asimismo, hemos identificado una inducción significativa en la activación de iNOS, mediada por la vía de señalización celular iNOS/NO. Esta vía, sin embargo, ha demostrado una actividad dual, promoviendo por un lado vasodilatación coronaria mejorando así el flujo sanguíneo y limitando el daño isquémico (422, 423); mientras que por otro lado, contribuiría con la formación de especies reactivas de nitrógeno que potenciarían el daño oxidativo celular durante el período de reperfusión. En nuestro trabajo, la actividad anti- oxidante de espirulina podría haber influenciado en limitar este daño oxidativo permitiendo mantener los efectos positivos derivados de la activación de iNOS/NO. Igualmente, hemos evidenciado posibles mecanismos adicionales de cardioprotección al exhibir un incremento en la actividad de TNF-a en los animales tratados con espirulina. TNF-a es un importante modulador de la actividad de iNOS, e interactúa con el receptor de TNF tipo 2 y modula la vía cardioprotectora mediada por SAFE, lo que podría redundar en una mayor capacidad del tejido cardíaco isquémico para atenuar el daño por I/R y limitar 109 así sus consecuencias deletéreas (424). No obstante, la inducción de TNF-a a nivel crónico podría ejercer un efecto adicional, símil al mencionado previamente por iNOS, provocando un impacto negativo a nivel del músculo cardíaco (425), por lo que se requeriría de información adicional para dilucidar la contribución global de TNF-a en la actividad de espirulina. Es importante remarcar que la acción de espirulina a nivel miocárdico se ha centrado no solamente en el tejido miocárdico sometido a isquemia, sino que también actúan de forma sinérgica sobre los cardiomiocitos remotos al área de lesión, demostrado a través de la mayor expresión y actividad de AMPK en todo el corazón de los animales tratados (isquémico y no isquémico). Esta vía de activación de AMPK ha sido asociada con una modulación positiva del metabolismo energético cardíaco en corazones bajo un evento isquémico (426-428), pudiendo contribuir a optimizar la reserva energética durante un síndrome coronario mejorando así la capacidad del tejido cardíaco para contrarrestar el daño por I/R. A nivel sistémico, los animales suplementados con espirulina demostraron un efecto anti- inflamatorio aditivo secundario a una menor expresión de Cox-2 en forma aguda post-IAM, sin observarse cambios significativos en los niveles de IL-1b, aunque esta actividad podría haberse debido a una menor presencia del complejo inflamasoma NLRP3 en la lesión post- infarto encargado de procesar las formas activas de IL-1b (429). Figura 13. Mecanismos de acción de espirulina. AMPK: Protein-quinasa activada por monofosfato de adenosina; Cox-2: Ciclooxigenasa-2; iNOS: Óxido nítrico sintetasa inducible; TNF-a: Factor de necrosis tumoral alfa. 8-oxo-2'-desoxiguanosina Expresión miocárdica de MCP-1 Expresión sistémica Cox-2 Actividad de TNF-a en miocardio Expresión miocárdica de AMPK Reduce el daño oxidativo del ADN Efecto anti-inflamatorio Limita el daño por isquemia-reperfusión Actividad iNOS en miocardio Modulador del metabolismo energético Mejoría del flujo coronario 110 El segundo objetivo consistió en investigar si la administración de Silybum marianum es capaz de mitigar el remodelado ventricular adverso desencadenado tras un IAMCEST. Como se ha podido evidenciar, hemos demostrado que la suplementación regular con Silybum marianum produjo una reducción significativa en los niveles de triglicéridos a nivel sistémico mediada por una disminución en su absorción intestinal, que a su vez se asoció a una reducción en la acumulación de triglicéridos a nivel miocárdico (lipotoxicidad cardíaca) limitando así los cambios celulares y estructurales que redundan en un mayor grado de disfunción ventricular y remodelado ventricular adverso. En este trabajo, primeramente reportamos que la suplementación con Silybum marianum induce una disminución significativa y selectiva de los niveles plasmáticos de triglicéridos, sin afectar el resto de lipoproteínas específicas. Este efecto hipotrigliceridémico selectivo, observado en forma aguda desde 1 hora post-administración de Silybum marianum, fue secundario a una reducción superior al 50% en la absorción intestinal de triglicéridos, nuevamente sin afectar el contenido de otros lípidos neutros en el intestino delgado (i.e., ésteres del colesterol intestinal y colesterol libre). A su vez, descartamos otros potenciales mecanismos de reducción de triglicéridos, como aquellos derivados de una mayor captación en el tejido adiposo periférico, dada la disminución registrada en el receptor de la lipoproteína de muy baja densidad (VLDL-R) y LPL a 3 semanas post-infarto. Este fenómeno, a su vez, se asoció con una disminución significativa en la expresión proteica de la proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP1) y VLDL-R en el duodeno, junto a su incremento compensatorio en el yeyuno, permitiendo identificar las vías posiblemente involucradas en la reducción de la absorción intestinal del triglicéridos. Asimismo, se observó una disminución significativa en la expresión proteica de la glicoproteína P. Esta glicoproteína se encuentra codificada dentro del gen de mutación de resistencia a multidrogas 1 (MDR1 por sus siglas en inglés), responsable del metabolismo de múltiples compuestos y fármacos. La utilización de Silybum marianum ha sido relacionada previamente con la activación de esta vía metabólica (430-432), aunque dada la condición altamente polimórfica de este gen y la variabilidad en la expresión de la glicoproteína P (433), su real significado clínico resulta incierto, y se requiere de información adicional para valorar las potenciales interacciones entre este nutracéutico y el tratamiento farmacológico complementario presente en esta población. Posteriormente, analizamos el impacto de la ingesta regular de Silybum marianum sobre la esteatosis cardíaca a 3 semanas post-infarto. Nuestros datos evidencian un claro papel cardioprotector de Silybum marianum para limitar la lipotoxicidad miocárdica y reducir el grado de disfunción ventricular post-infarto. Se ha descrito con anterioridad que un evento 111 coronario agudo da lugar a un proceso de infiltración lipídica a nivel cardíaco que induce la expansión de la cicatriz necrótica del infarto y contribuye así, secundariamente, a la disfunción sistólica isquémica (434-436). A su vez, esta toxicidad lipídica se encuentra mediada directamente por la acumulación de triglicéridos en tejido miocárdico, inicialmente viable, favoreciendo el desarrollo de fibrosis ventricular y el remodelado cardíaco adverso (436). En nuestro trabajo, la administración regular de Silybum marianum no evidenció cambios significativos respecto al contenido miocárdico de triglicéridos en forma aguda post-reperfusión (a 2,5 horas luego de un IAMCEST). Sin embargo, sí consiguió modificar en forma significativa la acumulación de triglicéridos a nivel del tejido cardíaco isquémico a las 3 semanas del evento. Aunque no se observó correlación directa entre el grado de infiltración de triglicéridos con la función ventricular, estos efectos beneficiosos se asociaron con una recuperación de la contractilidad cardíaca y limitación del remodelado ventricular post-infarto, por lo que las propiedades citoprotectoras y anti- oxidantes de Silybum marianum podrían haber contribuido directamente al incremento observado en la FEVI. La actividad cardioprotectora de Silybum marianum ha sido valorada en varios estudios previos, aunque en su mayor proporción las investigaciones han sido llevadas a cabo in vitro o en modelos de pequeños animales. Por un lado, el empleo de Silybum marianum ha demostrado en un modelo murino optimizar la función cardíaca y reducir el tamaño final del infarto así como la fibrosis intersticial a través de una atenuación en la disfunción mitocondrial, reduciendo la apoptosis de cardiomiocitos y ejerciendo una actividad anti- inflamatoria y anti-oxidante durante el daño por I/R (437). A nivel mecanístico, Silybum marianum también ha evidenciado un efecto citoprotector al reducir la activación de las caspasas 9 y 12, responsables de los mecanismos de apoptosis celular, y por otro lado atenuar el efecto de la enzima catalasa y la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa 2 y 4 (NOX 2-4), estimulando a la vez la citoquina relacionada con el factor nuclear eritroide 2 (Nrf2), todo lo cual contribuye a limitar la respuesta pro-oxidativa post-IAM. Asimismo, ha probado mejorar la capacidad mitocondrial y del retículo endoplásmico de respuesta al estrés, induciendo una intensa actividad anti-inflamatoria basada en la inhibición final de NF-kb, atenuando la activación del complejo inflamasoma NLRP3 y disminuyendo los niveles de TNF-a e IL-6 (437-439), de esta forma restringiendo efectivamente la progresión de la respuesta pro-inflamatoria. Adicionalmente, Silybum marianum ha demostrado una actividad sinérgica al régimen anti- trombótico con clopidogrel, disminuyendo la inflamación y disfunción endotelial, y reduciendo el progreso de la lesión aterosclerótica en un modelo murino (440). Se ha postulado que este fenómeno ocurriría por una disminución en la oxidación de moléculas 112 de C-LDL (441, 442), así como por una reducción en los niveles de dimetilarginina asimétrica (ADMA) vascular y plasmática, aumentando los niveles de NO disponible con la consiguiente vasodilatación y citoprotección asociada (443, 444). Igualmente, en un modelo de conejo hipercolesterolémico, Silybum marianum ha evidenciado un efecto anti- aterogénico al reducir el crecimiento y desarrollo de las placas de aterosclerosis, en forma dosis-dependiente (hasta 200 mg/kg/día de silimarina administrada) (445). Por último, en el campo clínico Silybum marianum se ha empleado en forma de condicionamiento farmacológico en 140 pacientes sometidos a cirugía de revascularización miocárdica, demostrando una reducción significativa en la inflamación post-quirúrgica, con una modulación positiva a nivel del metabolismo lipídico y glucémico, aunque dichos hallazgos no se asociaron a una disminución en eventos clínicos mayores (446). Nuestros hallazgos demuestran que Silybum marianum es capaz de limitar la cardiolipotoxicidad a través de dos mecanismos fundamentales: la inducción en la expresión de receptores encargados de prevenir la acumulación intra-miocárdica de triglicéridos (principalmente derivada de la activación de LRP1 y VLDL-R), y un efecto positivo sobre el metabolismo lipídico cardíaco mediante la inducción de receptores con actividad hipotrigliceridémica como CD-36, LPL y el receptor activado por proliferador peroxisomal gamma (PPAR-g). Tanto la inhibición de VLDL-R como LRP1 han sido relacionados con un incremento en la infiltración cardiaca de triglicéridos y mayor mortalidad post-infarto (447, 448) por lo que su modulación por Silybum marianum promovería una optimización en el metabolismo lipídico cardíaco reduciendo así las consecuencias deletéreas de la lipotoxicidad. Adicionalmente, la participación de CD-36 y LPL, que en condiciones fisiológicas promueven la beta-oxidación de ácidos grasos como fuente de energía principal para el mantenimiento de la función cardíaca, ha sido analizada en modelos animales de pérdida de función demostrando un daño directo derivado de la acumulación lipídica de triglicéridos (449, 450). En este trabajo, los animales suplementados con Silybum marianum demostraron un aumento en la expresión de LPL y CD-36 a nivel del tejido miocárdico isquémico y de todo el VI, respectivamente, atenuando la toxicidad cardíaca por triglicéridos. Por su parte, la actividad de PPAR-g en los animales suplementados con Silybum marianum se incrementó en forma significativa en todo el tejido miocárdico en comparación a controles. La actividad de PPAR-g consiste en limitar la infiltración de triglicéridos, cuya capacidad se ha observado que depende en gran medida de la inducción complementaria de LPL (451), habiéndose registrado en nuestro trabajo una activación sinérgica de ambos receptores. Nuevamente, en forma análoga a lo descripto por la espirulina, Silybum marianum actúo sobre todo el miocardio y no sólo en 113 los cardiomiocitos isquémicos en riesgo, lo cual demuestra el perfil integral de este nutracéutico en influenciar positivamente todo el tejido cardíaco. Estas modificaciones también se asociaron con un incremento en la expresión de glicoproteína P a nivel del tejido infartado en animales bajo efecto de Silybum marianum. Esta glicoproteína ha sido señalada como responsable de un potencial mecanismo compensador frente a la hipoxia celular (452), por lo que su inducción en este caso podría contribuir a la resistencia de los cardiomiocitos sometidos a isquemia y daño por I/R. Por último, dado que la suplementación con Silybum marianum no indujo cambios significativos en corazones sanos no sometidos a la inducción del IAM, se podría inferir que la actividad global de este nutracéutico no sólo derivaría de la debida reducción en los niveles plasmáticos de triglicéridos sino a un efecto directo sobre el tejido miocárdico para limitar la lipotoxicidad y mejorar de esta forma la función ventricular post-infarto. Figura 14. Mecanismos de acción de Silybum marianum. CD-36: Clúster de diferenciación-36; LPL: Lipoproteinlipasa; LRP1: Proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad; PPAR-g: Receptor activado por proliferador peroxisomal gamma; VLDL-R: Receptor de lipoproteína de muy baja densidad. 7.5. Perfil de bioseguridad de Espirulina y Silybum marianum La suplementación de animales con preparados nutracéuticos correspondió en ambos casos a versiones comercialmente disponibles, sin requerir de formulaciones especiales y siendo administradas por vía oral. Tanto espirulina como Silybum marianum demostraron una adecuada tolerancia oral, con ausencia de efecto sobre el metabolismo glucémico y el perfil lipídico (a excepción de la actividad hipotrigliceridémica de Silybum marianum). A diferencia de este último, la espirulina produjo un impacto en el peso corporal de los animales tratados reduciendo significativamente la progresión de la ganancia de peso esperada. Expresión LRP1 y VDLD-R en duodeno Actividad CD-36, LPL y PPAR-g en miocardio Expresión LRP1 y VLDL-R en miocardio Actividad glicoproteína-P en miocardio Reduce la absorción intestinal de triglicéridos Previene la lipotoxicidad cardíaca Limita los mecanismos de hipoxia celular 114 Globalmente, ambos nutracéuticos probaron exhibir un correcto perfil de bioseguridad sin haberse demostrado la aparición de efectos adversos, y sin producir alteraciones significativas a nivel de la función hepática o renal, en un modelo porcino homólogo en gran medida a la fisiopatología humana. 7.6. Limitaciones Esta tesis doctoral, teniendo en cuenta los estudios de investigación previos y la evidencia disponible, ha buscado reducir al mínimo la presencia de limitantes que impidan su apropiada interpretación y posterior traslación al ámbito clínico. Sin embargo, es necesario dejar constancia la presencia de determinados factores que puedan tener un rol en limitar los resultados desarrollados previamente. Por un lado, si bien existe una estrecha correlación entre el modelo porcino y la fisiopatología humana, en donde en ambos sistemas la inducción de una oclusión a nivel coronaria mediante el inflado de un balón percutáneo permite generar áreas de tejido isquémico, estos mecanismos distan de poseer los mismas bases moleculares y celulares sobrevenidas durante la aparición de un evento aterotrombótico, que consisten en lesiones ateroscleróticas que sufren un evento de rotura/erosión de la placa y estimulan respuestas pro-trombóticas e inflamatorias a dicho nivel, como se ha mencionado previamente. Asimismo, en forma semejante a los humanos, la complicación más frecuentemente presentada en el modelo porcino durante la inducción de un infarto agudo de miocardio en forma percutánea lo constituye la aparición de arritmias ventriculares malignas, que pueden manifestarse tempranamente luego de a oclusión coronaria y se extienden durante todo el período de isquemia y reperfusión (413, 453). Por lo tanto, se han establecido diversos protocolos de profilaxis anti-arrítmica para prevenir su aparición, basados principalmente en la administración en perfusión endovenosa de amiodarona (454, 455). Sin embargo, esta técnica se ha visto que podría inducir un efecto cardioprotector promoviendo una reducción en el área final del infarto al disminuir la demanda miocárdica de oxígeno (456, 457), lo cual podría interferir con los resultados obtenidos, aunque esta evidencia proviene de estudios antiguos sin haber podido ser corroborados en el contexto del tratamiento farmacológico actual. En forma análoga, los anestésicos utilizados durante el procedimiento podrían ofrecer cierto grado de protección adicional. Principalmente el isoflurano inhalatorio, que ha demostrado disminuir el tamaño del infarto mediante la activación de canales de potasio dependientes de ATP (411, 458). Sin embargo, al utilizar la misma aproximación anestésica y anti-arrítmica en todos los animales control y tratados, se ha buscado homogeneizar así un posible efecto protector para reducir la posibilidad de un potencial factor confundidor. 115 A su vez, existen algunas otras consideraciones a tener en cuenta al evaluar los modelos experimentales de cardiopatía isquémica. Primero, a diferencia de los humanos, los animales en investigación suelen ser de edad joven, lo cual implicaría una mayor capacidad de recuperación, y a su vez, no existiría la influencia multifactorial de los distintos factores de riesgo CV presentes en el desarrollo de los procesos de aterosclerosis y enfermedad coronaria (459). Por tanto, existe todavía una brecha a considerar entre los modelos animales disponibles en la actualidad, más enfocados en procesos trombogénicos y sus consecuencias isquémicas, frente a la compleja realidad de la enfermedad aterosclerótica humana de etiología multifactorial, lo que demandaría el desarrollo de prototipos de enfermedad más fidedignos que permitan obtener resultados consistentes y posibiliten su traslación con el menor nivel de error posible. Por último, la inducción de un IAMCEST sin la influencia del tratamiento médico farmacológico coadyuvante no permite excluir la posibilidad de interacciones entre los nutracéuticos administrados y las medicaciones presentes en estas situaciones clínicas, aunque ambos nutracéuticos particularmente han sido analizados en pacientes de riesgo CV y no se ha encontrado evidencia de efectos adversos derivados de la posible interacción con la medicación presente. 116 8. CONCLUSIONES En conclusión, esta tesis doctoral ha tenido como objetivo principal evaluar el potencial cardioprotector derivado mediante la administración de dos nutracéuticos, la espirulina y Silybum marianum, en un modelo porcino de IAMCEST. En dicho escenario clínico, se han demostrado las siguientes conclusiones: La suplementación con espirulina induce un significativo efecto anti-inflamatorio, antioxidante y anti-apoptótico a nivel de tejido miocárdico isquémico permitiendo reducir el tamaño final del infarto y consiguiendo una mejoría significativa en la función ventricular. A pesar de no producir impacto metabólico significativo, los animales suplementados con espirulina evidenciaron una menor progresión de aumento de peso, no derivada de una menor ingesta calórica, lo cual podría tener potenciales implicaciones en el manejo de la obesidad asociada al resto de los factores de riesgo cardiovascular. Por su parte, la administración de Silybum marianum permitió evidenciar una disminución aguda y significativa en los niveles plasmáticos de triglicéridos, sin impacto en el resto de lipoproteínas circulantes. Esta actividad hipotrigliceridémica fue mediada por una reducción en la absorción intestinal de triglicéridos, sin haberse visto modificados el contenido remanente de ésteres de colesterol y colesterol libre intestinal. Asimismo, la suplementación con Silybum marianum mitigó las consecuencias deletéreas de la cardiolipotoxicidad a 3 semanas del evento isquémico coronario. Este beneficio se asoció a un aumento en los receptores encargados de la eliminación lipídica a nivel cardíaco y condujo a la atenuación de remodelado ventricular adverso y a una mejora de la función contráctil miocárdica. Es importante remarcar que la administración de ambos nutracéuticos (espirulina y Silybum marianum) exhibieron un adecuado perfil de bioseguridad, no registrándose eventos adversos en los animales suplementados y sin afectar significativamente los parámetros hematológicos ni la función hepática o renal. 117 Por lo tanto, el trabajo de investigación de esta tesis doctoral ha demostrado que el condicionamiento miocárdico con nutracéuticos (i.e., espirulina y Silybum marianum) puede representar una estrategia novedosa, efectiva, segura y de bajo coste capaz de ejercer efectos cardioprotectores directos en el marco de un IAMCEST, limitando así el remodelado ventricular adverso y favoreciendo la recuperación de la función cardíaca post- infarto. 118 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Joseph P, Leong D, McKee M, Anand SS, Schwalm JD, Teo K, et al. Reducing the Global Burden of Cardiovascular Disease, Part 1: The Epidemiology and Risk Factors. Circ Res. 2017;121(6):677-94. 2. 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