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Desarrollo de Nanopartículas Lipídicas para vehiculizar siRNA a través de la Barrera Hematoencefálica

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Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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[spa] La administración de medicamentos hacia el sistema nervioso central (SNC) es uno de los principales retos en la neurofarmacología, principalmente debido a la presencia de la barrera hematoencefálica (BHE). Aunque esta barrera es crucial para mantener la homeostasis al excluir toxinas y patógenos, también limita drásticamente el paso de más del 98 % de los fármacos convencionales y prácticamente todos los biofármacos, incluyendo los ácidos nucleicos.
En este contexto, el uso de nanopartículas, y en particular de nanopartículas lipídicas, ha ganado relevancia como una estrategia para mejorar la entrega de terapias al cerebro. Las nanopartículas lipídicas presentan propiedades físico químicas que le permiten enfrentar el reto que significa la barrera hematoencefálica. Particularmente su pequeño tamaño y su capacidad de modificación superficial con ligandos específicos para el direccionamiento activo. Adicionalmente, en la última década, han emergido como el tipo de vehículo más apto, y con éxito en la aplicación clínica, para el direccionamiento de terapias con ácidos nucleicos.
En esta investigación, se desarrolló una formulación base de nanopartículas lipídicas ionizables (LNPs) destinada a la vehiculización de siRNA a través de la BHE. Las nanopartículas se preparan mediante la mezcla microfluídica de soluciones lipídicas en etanol, y soluciones acuosas de siRNA. El proceso de desarrollo se guio por los principios de Calidad por Diseño (QbD), permitiendo un entendimiento profundo de los parámetros críticos de proceso (CPP) y de formulación que afectan los atributos críticos de calidad (CQA) de las nanopartículas. Esto facilitó la optimización del tamaño de partícula, el potencial zeta, el índice de polidispersidad y la eficiencia de encapsulación, garantizando que la formulación fuera reproducible y estable para aplicaciones futuras. 
Durante exploraciones experimentales de esta investigación, surgieron hallazgos que desafían algunas de las nociones establecidas en el estado del arte de la fabricación de nanopartículas lipídicas, particularmente en lo que respecta a los parámetros críticos de proceso (CPP) y de formulación. Por ejemplo, se descubrió que la diálisis, generalmente considerada un paso secundario, impacta de manera significativa el tamaño de partícula, el potencial zeta y el PDI, además de modificar la influencia del flujo de razón (FRR), un parámetro clave en la fabricación. Asimismo, se determinó que solo una fracción de la maleimida añadida está disponible en la superficie de las nanopartículas para la funcionalización, lo que resalta la importancia de cuantificarla como un atributo crítico de calidad (CQA) en lugar de asumir que toda la cantidad agregada es funcional.
Una vez establecida la formulación base, se avanzó hacia la funcionalización de las nanopartículas para potenciar su capacidad de atravesar la BHE. Se emplearon diferentes péptidos, seleccionados a partir de una revisión sistemática exhaustiva, como Angiopep-2, RVG, MiniAp-4 y THRre, los cuales se acoplaron a las nanopartículas mediante reacción con la maleimida. El tiempo de incubación, pH y proporción maleimida a péptido fueron optimizados para asegurar una alta eficiencia de funcionalización.
Finalmente, las nanopartículas demostraron ser biocompatibles y eficaces en la internalización celular y el silenciamiento génico en modelos celulares in vitro, lo que evidenció su capacidad para transportar y liberar siRNA dentro del citoplasma. Adicionalmente, estudios preliminares de biodistribución in vivo mostraron que las nanopartículas, incluso sin funcionalizar, lograron acumularse en el cerebro, confirmando su potencial para aplicaciones terapéuticas en el SNC.

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[eng] The delivery of therapeutic agents into the central nervous system (SNC) remains one of the main challenges in neuropharmacology, primarily due to the presence of the blood-brain barrier (BHE). While this barrier is crucial for maintaining homeostasis by excluding toxins and pathogens, it also drastically limits the passage of over 98% of conventional drugs and almost all biopharmaceuticals, including nucleic acids.
In this context, the use of nanoparticles, particularly lipid nanoparticles, has gained prominence as a strategy to enhance brain-targeted therapy delivery. Lipid nanoparticles possess physicochemical properties that enable them to overcome the challenges arising from the BHE, such as small size and the capacity for surface modification with targeting ligands. Additionally, over the past decade, lipid nanoparticles have emerged as the most suitable vehicle for delivering nucleic acid-based therapies, with notable clinical success.
This study developed a base formulation of ionizable lipid nanoparticles (LNPs) designed for siRNA delivery across the BBB. The nanoparticles were prepared using microfluidic mixing of lipid solutions in ethanol with aqueous siRNA solutions. The development process was guided by Quality by Design (QbD) principles, allowing for a deep understanding of the critical process parameters (CPP) and formulation attributes that influence the critical quality attributes (CQA) of the nanoparticles. This facilitated the optimization of particle size, zeta potential, polydispersity index (PDI), and encapsulation efficiency, ensuring a reproducible and stable formulation for future applications.
During experimental investigations, several findings emerged that challenge established notions in LNPs fabrication, particularly concerning critical process and formulation parameters. For instance, dialysis, often considered a secondary step, was found to significantly affect particle size, zeta potential, and PDI, while also altering the influence of the flow rate ratio (FRR), a key parameter in nanoparticle fabrication. Additionally, it was found that only a fraction of the maleimide added to the formulation is available on the nanoparticle surface for functionalization, underscoring the importance of quantifying maleimide as a CQA rather than assuming full functionality of the added amount.
After establishing the base formulation, functionalization of the nanoparticles was performed to enhance their ability to cross the BHE. Various peptides, selected from a comprehensive systematic review, including Angiopep-2, RVG, MiniAp-4, and THRre, were conjugated to the nanoparticles via maleimide-based chemistry. The incubation time, pH, and maleimide-to-peptide ratio were optimized to ensure high functionalization efficiency.
Finally, the nanoparticles demonstrated biocompatibility and efficacy in cellular internalization and gene silencing experiment in in vitro cell models, confirming their ability to transport and release siRNA into the cytoplasm. Preliminary in vivo biodistribution studies further indicated that the nanoparticles, even the non-functionalized, were able to accumulate in the brain. These results confirm the potential of LNPs for therapeutic applications in the SNC, opening the gates to future advancements in treating a broad spectrum of neurological and psychiatric disorders and brain tumours.

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cc by-nc-sa (c) Vargas Monge, Ronny, 2025

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Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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Desarrollo de Nanopartículas Lipídicas para vehiculizar siRNA a través de la Barrera Hematoencefálica