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Bacteriófagos portadores del gen de la Stx 2 en aguas

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Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia

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[spa] Los bacteriófagos portadores de genes están relacionados con la patogenicidad de las bacterias a las que infectan. Los fagos representan, pues, potenciales elementos móviles entre especies bacterianas filogenéticamente cercanas. La producción de Stx se ha demostrado en otras enterobacterias distintas de "E. coli", por tanto, la transferencia del carácter mediada por lisogenización de los fagos portadores del gen de la Stx 2, podría explicar la presencia de las toxinas Stx en diferentes cepas bacterianas, así como el amplio rango de variabilidad de la familia de las toxinas de "Shigella".Hasta el momento, ningún estudio previo permitía estimar la cantidad de fagos portadores de genes implicados en patogenicidad circulantes en el medio ambiente. Los resultados obtenidos dan información sobre la cantidad de estos fagos en muestras de agua residual, de su amplia distribución y de su persistencia ante diferentes procesos de inactivación.A fin de detectar la presencia de los fagos portadores del gen de la Stx 2 en agua residual se aplicó una metodología basada en la amplificación del gen de la Stx 2, transportado por estos fagos, mediante la técnica de la PCR. Para ello se purificaron bacteriófagos a partir de diferentes volúmenes de agua residual del área urbana de Barcelona, se extrajo el ADN de dichos fagos y se amplificó un fragmento del gen de la Stx2 por PCR anidada.Los resultados obtenidos por PCR anidada se corroboraron mediante "Southern blot" y "dot blot", hibridando con una sonda radiactiva específica. Asimismo, los amplímeros obtenidos por PCR anidada fueron secuenciados y comparados con la secuencia del gen de la Stx 2, inserto en el bacteriófago 933 W (código EMBL X07865), verificándose que realmente se estaba amplificando el gen de la Stx 2.Se pretendió comprobar, además, si los fagos portadores del gen de la Stx 2 eran infecciosos para una cepa de "E. coli" 0157:H7. Para ello se realizaron cultivos de enriquecimiento con una cepa de "E. coli" 0157:H7 (ATCC 43888) no portadora del gen de la toxina. Estos cultivos se enriquecieron con fagos parcialmente purificados de agua residual y se incubaron a fin de permitir la multiplicación de los fagos. Se purificaron los fagos presentes en los sobrenadantes de los cultivos de enriquecimiento, se extrajo su ADN y se amplificó el gen de la Stx 2 por PCR anidada. La infectividad de estos fagos para 0157:H7 quedó demostrada con el hecho de que se detectaran en volúmenes de 0,1 ml de agua residual (llegando en una ocasión a ser detectados en 0,02 ml), después de haber infectado un cultivo de 0157:H7, mientras que no se detectaban en los mismos volúmenes cuando se analizaba directamente la muestra, sin enriquecimiento previo. La caracterización complementaria de los amplímeros obtenidos ("dot blot" y "SouthemBlot"), así como el estudio de las secuencias de dichos amplímeros mostraron que, efectivamente, se detectó el gen de la toxina presente en el genoma de fagos purificados de agua residual infecciosos para "E. coli" 0157:H7.Se quiso verificar si la infección de fagos portadores del gen de la Stx 2 a una cepa de "E. coli" 0157:H7 no portadora del gen de la toxina (ATCC 43888), podía inducir la producción de la toxina Stx 2 por parte de dicha cepa. Para comprobarlo, se detectó la subunidad A de la Stx 2 en el sobrenadante de los cultivos de 0157:H7 infectados con fagos purificados de agua residual, mediante "Westem blot" e inmunodetección con anticuerpos monoclonales específicos contra la subunidad A de la Stx 2. Dicha subunidad fue detectada en todos los sobrenadantes analizados.A fin de verificar si la toxina producida era o no funcional se realizaron pruebas de citotoxicidad. Para ello se inocularon 0,1 mI de los sobrenadantes obtenidos a partir de los cultivos de enriquecimiento sobre un cultivo de células Vero. Los resultados mostraron citotoxicidad en algunas de las pruebas realizadas. Estos resultados, así como los obtenidos mediante "Westem blot", demostraron que algunos de los fagos portadores del gen de la Stx 2 infecciosos para 0157:H7 presentes en agua residual, transportan el gen completo en su genoma y que éste se expresa en su totalidad.A partir de los resultados obtenidos mediante PCR anidada, se realizó la estimación del número de fagos portadores del gen de la Stx 2 en agua residual del área urbana de Barcelona. Para ello, se agruparon todas las muestras de un mismo origen y se calculó, para cada volumen de muestra analizada, el número de muestras que presentaron resultado positivo respecto al total de muestras analizadas. A estos resultados se aplicó la técnica del Número Más Probable. La aproximación realizada indicó que el número de fagos portadores del gen de la Stx 2 infecciosos para 0157:H7 en aguas residuales del área urbana de Barcelona oscila entre 1 y 10 fagos/ml de agua residual. Esto representa aproximadamente el 1 % del conjunto de fagos infecciosos para 0157:H7.Siguiendo la misma metodología, se pudo detectar también la presencia de fagos portadores del gen de la Stx 2 en aguas residuales de distintos orígenes geográficos, algunas de ellas con contaminación de origen animal. Por ello hay que considerar la presencia de fagos portadores del gen de la Stx 2 en agua residual como un hecho general, aunque más variable que la presencia de "E.coli", colifagos somáticos o los fagos que infectan a 0157:H7.Asimismo, se estudiaron las secuencias del fragmento del gen de la Stx 2 amplificado mediante PCR anidada. Este estudio mostró que en su mayoría los amplímeros mostraban idéntica secuencia que el gen de la Stx 2. Sin embargo, algunos de los amplímeros secuenciados mostraban ciertas diferencias, demostrando la variabilidad de los fagos-Stx 2. Este estudio abre la posibilidad de que existan fagos portadores de genes que codifican para alguna variable de la Stx 2, por lo que consideramos que la metodología empleada podría ser útil para determinar la presencia de fagos portadores de los genes que codifican para las variables de la Stx 2.Se realizaron estudios a fin de evaluar la persistencia de los fagos portadores del gen de la Stx 2, demostraron que estos fagos presentan una gran persistencia ante diferentes procesos de inactivación natural y tratamientos de depuración siempre muy superior a "E. coli" 0I57:H7.Por último, se realizó un estudio basado en la inactivación diferencial de distintas morfologías de colifagos somáticos frente a diferentes procesos de inactivación natural y tratamientos de depuración. Los resultados obtenidos indicaron que los fagos del tipo "Siphoviridae" presentan mayor persistencia a los procesos de inactivación que otros tipos morfológicos de bacteriófagos. Teniendo en cuenta que los fagos portadores del gen de la Stx 2 corresponden a la familia "Siphoviridae", esto implica que estos fagos son más persistentes ante procesos de inactivación atendiendo a su morfología. Dado que los bacteriófagos son, en general, más resistentes que "E. coli" a la desinfección (Sobsey y col., 1989), a tratamientos de depuración (Jofre y col., 1995) y a la inactivación natural en aguas (Bell, 1976; Kott y col., 1968), se puede pensar que en realidad los bacteriófagos son los que actúan como reservorio natural de genes en el medio ambiente.Creemos que este trabajo abre interesantes perspectivas sobre el estudio de fagos que son portadores de genes que codifican para la Stx, y que debe determinarse la importancia de los fagos en la transferencia de estos genes entre diferentes especies de enterobacterias en condiciones naturales. Otros autores (Datz y col., 1996; Martins y col., 1992, Beutin y col., 1997) sugieren asimismo que serian interesantes más estudios encaminados a determinar la distribución de los bacteriófagos en ambientes acuáticos y determinar el papel que juegan como elementos de transmisión entre diferentes cepas bacterianas. Esta información podría dar lugar a que la política sanitaria actual, referida tanto a tratamientos de depuración de aguas como a prácticas sanitarias con alimentos, fuese ajustada a fin de minimizar riesgos.

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[eng] Shiga toxin-converting bacteriophages are involved in the pathogenicity of some enteric bacteria such as "Escherichia coli" 0I57:H7, but data on the occurrence and distribution of such phages in nature were not available.We developed an experimental approach to detect the presence of the Shiga toxin 2 (Stx2), encoding bacteriophages in sewage from Barcelona area. The Stx 2 gene was amplified by PCR from phages concentrated from sewage. MoReover, the phages carrying the Stx 2 gene were detected in supematants from bacteriophage enrichment cultures using a Stx 2 negative "E. coli" 0157:H7 infected with phages purified from sewage. Additionally, the A subunit of Stx 2 was detected in the supematants of the bacteriophage enrichment cultures, which also showed cytotoxic activity for Vero cells. Applying the most probable number technique to the obtained results, it was estimated that the number of phages infectious for "E. coli" 0157:H7 and carrying the Stx 2 gene was in the range of 1 to 10 per ml of sewage (approximately 1% of all phages infecting "E. coli" 0157:H7).We also detected the presence of phages carrying the Stx 2 gene in sewage samples from different geographic origins (8 different countries).A sequence of a fragment of the Stx 2 gene carried by these phages showed some variability and suggests that phages could carry Stx 2-variant genes.Studies of the persistence of phages carrying Stx 2 gene against the persistence of the strain of "E. coli" 0157:H7 to natural inactivation and to disinfection processes indicated that phages carrying the Stx 2 gene show higher persistence to inactivation processes than "E. coli" 0157:H7.Studies to evaluate the different persistence of different bacteriophage morphological types under inactivation processes (using water samples where natural inactivation occurs and for treatment processes) showed than "Siphoviridae" phages with flexible tails persist better to all these processes than other bacteriophage morphological types. As phages carrying Stx 2 gene are members of Siphoviridae family, these phages may be expected to be very persistent to inactivation processes. We concluded that phages carrying Stx 2 gene may be the reservoir of the Stx 2 gene in natural environments.

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Tesis Doctorals - Departament - Microbiologia

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Bacteriófagos portadores del gen de la Stx 2 en aguas