# name
Computational exploration of protein-ligand interactions: substrate selectivity and small molecule inhibition

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] The continuous development of molecular modelling and computational methods is pivotal in addressing the challenges encountered in the fields of biomedicine and drug design. Among them, the lack of structural and mechanistic information underlying protein dysfunction and drug resistance stands out. In this context, the present doctoral thesis focuses on elucidating the molecular interactions behind the mechanism of action (MOA) of two druggable targets that are directly involved in major public health concerns highlighted by the World Health Organization (WHO), namely cardiovascular disease (CVD) and infectious diseases.
In the first project, the mechanism and selectivity of the main cholesterol transporter in mammals, the Niemann-Pick C1-Like 1 transporter (NPC1L1) has been investigated. The imbalance of the correct blood lipid profile, caused by a dysregulation on cholesterol homeostasis, plays a key role in the development of CVD. Cholesterol is a fat-like substance endowed with a high physiological relevance in humans, and its homeostasis is tightly regulated by various cellular processes including the import in the small intestine and the reabsorption in the biliary ducts by the NPC1L1 importer. NPC1L1 can mediate the absorption of a variety of sterols but strikingly exhibits a large sensitivity to cholesterol epimerization. The existence of two distinct binding modes for cholesterol and epi-cholesterol to the N-terminal domain (NTD) of NPC1L1 provides the structural basis to rationalize the affinity difference between the two substrates. The configuration of the hydroxyl group of cholesterol and the presence of a structural water molecule are key features for the effective binding to NTD. In addition, the existence of a gating mechanism involved in the sterol binding to this protein domain was confirmed by the conformational rearrangements of the α8/β7 loop. Furthermore, distinct single-point mutations that impair cholesterol transport show a mild effect on the binding of cholesterol to the NTD, but a drastic influence on the conformational landscape of the α8/β7 loop in the apo species compared to the wild-type protein. Overall, these results support the functional role played by the α8/β7 loop in regulating the access of ligands to NPC1L1, and hence in assessing the impact of these mutations on diseases related to disruption of sterol absorption.
In the second project, the MOA of an anti-viral inhibitor against the Hemagglutinin (HA) of Influenza A virus (IAV) has been investigated. We explored the putative binding site and the binding mode of the pinanamine-based inhibitor M090, able to block the HA-mediated membrane fusion mechanism in early stages of the infection and active against a wide range of HA variants. The predicted binding site is located at the interface defined by the α-helix L802-A962 and by the loops P3011-K3181 and M592-L732, i.e. in close proximity to the main stem region of the HA trimer. The results obtained from relative binding free energy (RBFE) calculations show close agreement with the differences in inhibitory potency determined in antiviral assays for M090 and its derivatives, providing in silico validation of the proposed binding mode. In addition, the E742 → D drug-resistant mutation weakens the optimal hydrogen bonding network established between the loops forming the M090 binding site. Altogether, a change in the overall packing against the stem region of HA leads to a disruption of the binding mode thus explaining the loss of activity.
In the third project, we examined the binding site and the binding mode of the sulphonamide derivative VF-57a, synthesised by the group of Prof. Santiago Vázquez (Departament de Farmacologia, Toxicologia i Química Terapèutica, UB) and tested against IAV-infected MDKC cells by the group of Prof. Lieve Naesens (Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KUL). The compound shows sub-micromolar activities against A/H1N1 strains (EC50 = 0.31 µM and EC50 = 0.92 µM against A/Virginia/ATCC3/2009 and A/Puerto Rico/8/1934, respectively) and H5N1 strains (EC50 = 0.81 µM against A/bald eagle/Florida/W22-134-OP/2022). We predicted the binding site for VF-57a to be in close proximity to the binding site for the broad-spectrum inhibitor Arbidol (Umifenovir). In this pocket, the thiophene ring of VF-57a is stabilised by van der Waals contacts with V361, L491, P3081, F3091, V552 and L992 from one protomer and with L982 and L1022 from a second protomer. The ring containing the trifluoromethyl moiety is stabilised by π-stacking interactions with Y942 and F3091. In addition, RBFE predictions for VF-57a and some derivatives support the predicted MOA by showing a good correlation with the experimental activities.
By combining state-of-the-art computational chemistry methods with experimental data, this doctoral thesis facilitates the understanding of certain cholesterol-related physiological disorders and contributes to the development of new small molecules as antivirals against IAV.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] El desenvolupament continu de mètodes de modelització molecular és fonamental per afrontar els reptes que es plantegen en els camps de la biomedicina i el disseny de fàrmacs. Entre ells, destaquen la falta d'informació estructural i mecanística darrera de la disfunció de les proteïnes i la resistència als fàrmacs. En aquest context, la present tesi doctoral es centra en elucidar les interaccions moleculars responsables del mecanisme d'acció de dues dianes farmacològiques directament implicades en dos dels principals problemes de salut pública identificats per l'Organització Mundial de la Salut: les malalties cardiovasculars i les malalties infeccioses.
En el primer projecte, s'ha investigat el mecanisme i la selectivitat del principal transportador de colesterol en mamífers, el transportador el transportador Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1). El desequilibri del perfil lipídic sanguini, causat per una disrupció de l'homeòstasi del colesterol, té un paper clau en el desenvolupament de les malalties cardiovasculars. El colesterol és una substància similar al greix amb una importància fisiològica fonamental en els éssers humans, i, per tant, i la seva homeòstasi està estretament regulada per diversos processos cel·lulars, que inclouen la importació en l'intestí prim i la reabsorció en els conductes biliars per l'importador NPC1L1. NPC1L1 pot mediar en l'absorció d'una varietat de esterols, però sorprenentment mostra una gran sensibilitat a l’epimerització del colesterol. Hem descrit l'existència de dos modes d'unió diferents per al colesterol i l’epicolesterol al domini N-terminal (NTD) de NPC1L1, que expliquen les característiques moleculars responsables de la diferència d'afinitat entre tots dos substrats. La configuració del grup hidroxil del colesterol i la presència d'una molècula d'aigua estructural al lloc d’unió, són imprescindibles per a l'absorció efectiva. A més, confirmem l'existència d'un mecanisme d'obertura implicat en la unió dels esterols a aquest domini de la proteïna mitjançant el reordenament conformacional del loop α8/β7. D'altra banda, s'ha determinat que una sèrie de mutacions puntuals que disminueixen l’absorció de colesterol exerceixen un efecte lleu en la unió del colesterol al NTD, però al seu torn tenen una influència dràstica en el rang conformacional del loop α8/β7 en l'estat apo en comparació amb la proteïna no mutada. En conjunt, els resultats recolzen el paper funcional del loop α8/β7 en la regulació de l'accés de lligands a NPC1L1 i, per tant, en l'avaluació de l'impacte d'aquestes mutacions en malalties relacionades amb l'alteració de l'absorció d’esterols.
 
En el segon projecte, s'ha investigat el mode d'unió d’un d'inhibidor antiviral de la hemaglutinina (HA) del virus de la grip A (IAV). En aquest projecte, identifiquem el lloc d'unió putatiu i el mode d'unió de l'inhibidor M090 basat en la pinanamina, capaç de bloquejar el mecanisme de fusió de membrana mediat per HA en les primeres fases de la infecció i actiu contra una àmplia gamma de variants de HA. El lloc d'unió previst es localitza en la interfície definida per la α-hèlix L802-A962 i pels loops P3011-K3181 i M592-L732, és a dir, molt a prop de la regió principal del trímer de HA. Les prediccions d'energia lliure d'unió relativa (RBFE) mostren una estreta concordança amb les diferències en la potència inhibidora determinada en assajos antivirals per a M090 i els seus derivats, proporcionant així una validació in silico del mode d'unió proposat. A més, observem que la mutació E742 → D resistent al fàrmac, debilita la xarxa òptima d'enllaços d'hidrogen establerta entre els loops que formen el lloc d'unió de M090. En conjunt, demostrem que un canvi en l'empaquetament global enfront de la regió de la tija de l'HA condueix a una alteració del mode d'unió que explica la pèrdua d'activitat.
En el tercer projecte, identifiquem el lloc d'unió putatiu i el mode d'unió del derivat sulfonamida VF-57a, sintetitzat pel grup del Prof. Santiago Vázquez (Departament de Farmacologia, Toxicologia i Química Terapèutica, UB) i assajat enfront de cèl·lules MDKC infectades amb IAV pel grup de la Prof. Lieve Naesens (Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KUL). El compost mostra activitats submicromolars contra soques A/H1N1 (EC50 = 0.31 µM i EC50 = 0.92 µM contra A/Virginia/ATCC3/2009 i A/Puerto Rico/8/1934, respectivament) i soques H5N1 (EC50 = 0.81 µM contra A/bald eagle/Florida/W22-134-OP/2022). Els resultats indiquen que el lloc d'unió de VF-57a es  troba  molt  prop  del  lloc  d'unió  de  l'inhibidor  d'ampli espectre Arbidol (Umifenovir). En aquest lloc d’unió, l'anell de tiofè de VF-57a s'estabilitza mitjançant contactes de van der Waals amb V361, L491, P3081, F3091, V552 i L992 d'un protòmer i amb L982 i L1022 d'un segon protòmer. L'anell que conté el fragment trifluorometil s'estabilitza mitjançant interaccions π amb Y942 i F3091. A més, les RBFE per a VF-57a i els seus derivats de l'estudi de relacions estructura-activitat (SAR) donen suport al mode d'unió predit en mostrar una bona correlació amb les activitats experimentals.
Mitjançant la combinació dels últims avenços en mètodes de química computacional amb dades experimentals, aquesta tesi doctoral facilita la comprensió d'uns certs trastorns fisiològics relacionats amb el colesterol i contribueix al desenvolupament de noves molècules com a antivirals front el IAV.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[spa] El continuo desarrollo de métodos de modelización molecular es fundamental para afrontar los retos que se plantean en los campos de la biomedicina y el diseño de fármacos. Entre ellos, destacan la falta de información estructural y mecanística que provoca la disfunción de las proteínas y la resistencia a los fármacos. En este contexto, la presente tesis doctoral se centra en elucidar las interacciones moleculares que subyacen al mecanismo de acción de dos dianas farmacológicas directamente implicadas en dos de los principales problemas de salud pública identificados por la Organización Mundial de la Salud: las enfermedades cardiovasculares y las enfermedades infecciosas.
En el primer proyecto, se ha investigado el mecanismo y la selectividad del principal transportador de colesterol en mamíferos, el transportador Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1). El desequilibrio del perfil lipídico sanguíneo óptimo, causado por una desregulación de la homeostasis del colesterol, desempeña un papel clave en el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares. El colesterol es una sustancia similar a la grasa con una importancia fisiológica fundamental en los seres humanos, y su homeostasis está estrechamente regulada por diversos procesos celulares, incluida la importación en el intestino delgado y la reabsorción en los conductos biliares por el importador NPC1L1. NPC1L1 puede mediar en la absorción de una variedad de esteroles, pero sorprendentemente muestra una gran sensibilidad a la epimerización del colesterol. Hemos revelado la existencia de dos modos de unión distintos para el colesterol y el epicolesterol al dominio N-terminal (NTD) de NPC1L1, proporcionando las características moleculares responsables de la diferencia de afinidad entre ambos sustratos. La configuración del grupo hidroxilo del colesterol y la presencia de una molécula de agua estructural, son características clave para la absorción efectiva. Además, confirmamos la existencia de un mecanismo de apertura implicado en la unión del esterol a este dominio de la proteína mediante los reordenamientos conformacionales del loop α8/β7. Por otra parte, se ha determinado que una serie de mutaciones puntuales que alteran el transporte de colesterol ejercen un efecto leve en la unión del colesterol al NTD, pero a su vez ejercen una influencia drástica en el rango conformacional del loop α8/β7 en la especie apo en comparación con la proteína no mutada. En conjunto, los resultados respaldan el papel funcional desempeñado por el loop α8/β7 en la regulación del acceso de ligandos a NPC1L1 y, por tanto, en la evaluación del impacto de estas mutaciones en enfermedades relacionadas con la alteración de la absorción de esteroles.
 
En el segundo proyecto, se ha investigado el modo de unión de un inhibidor antiviral frente la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A (IAV). En este proyecto, desvelamos el sitio de unión putativo y el modo de unión del inhibidor M090 basado en la pinanamina, capaz de bloquear el mecanismo de fusión de membrana mediado por HA en las primeras fases de la infección y activo frente a una amplia gama de variantes de HA. El sitio de unión previsto se localiza en la interfaz definida por la α-hélice L802-A962 y por los loops P3011-K3181 y M592-L732, es decir, muy cerca de la región principal del trímero de HA. Las predicciones de energía libre de unión relativa (RBFE) muestran una estrecha concordancia con las diferencias en la potencia inhibidora determinada en ensayos antivirales para M090 y sus derivados, proporcionando una validación in silico del modo de unión propuesto. Además, descubrimos que la mutación E742 → D, resistente al fármaco, debilita la red óptima de enlaces de hidrógeno establecida entre los loops que forman el sitio de unión de M090. En conjunto, un cambio en el empaquetamiento global frente a la región del tallo de la HA conduce a una alteración del modo de unión que explica la pérdida de actividad.
En el tercer proyecto, revelamos el sitio de unión putativo y el modo de unión del derivado sulfonamida VF-57a, sintetizado por el grupo del Prof. Santiago Vázquez (Departament de Farmacologia, Toxicologia i Química Terapèutica, UB) y ensayado frente a células MDKC infectadas con IAV por el grupo de la Prof. Lieve Naesens (Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KUL). El compuesto muestra actividades submicromolares frente cepas A/H1N1 (EC50 = 0.31 µM y EC50 = 0.92 µM frente A/Virginia/ATCC3/2009 y A/Puerto Rico/8/1934, respectivamente) y cepas H5N1 (EC50 = 0.81 µM frente A/bald eagle/Florida/W22-134-OP/2022). Los resultados revelan que el sitio de unión del VF-57a se encuentra muy cerca del sitio de unión del inhibidor de amplio espectro Arbidol (Umifenovir). En este bolsillo, el anillo de tiofeno del VF-57a se estabiliza mediante contactos de van der Waals con V361, L491, P3081, F3091, V552 y L992 de un protómero y con L982 y L1022 de un segundo protómero. El anillo que contiene el fragmento trifluorometilo se estabiliza mediante interacciones π con Y942 y F3091. Además, las RBFE para VF-57a y algunos derivados del estudio SAR apoyan el modo de unión predicho al mostrar una buena correlación con las actividades experimentales.
Mediante la combinación de los últimos avances en métodos de química computacional con datos experimentales, esta tesis doctoral facilita la comprensión de ciertos trastornos fisiológicos relacionados con el colesterol y contribuye al desarrollo de nuevas moléculas como antivirales frente el IAV.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.title[].value
Computational exploration of protein-ligand interactions: substrate selectivity and small molecule inhibition