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Actividad anti-inflamatoria e inmunomoduladora de los inhibidores solubles del complemento C4BP ß- y factor H

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina

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[spa] El sistema de complemento es parte fundamental de la inmunidad innata, actúa reconociendo patrones moleculares asociados a microorganismos y patógenos, provenientes de ambiente extracelular. Su función principal es la eliminación de dichos patógenos, pero además contribuye al mantenimiento de la homeostasis y a la prevención de la autoinmunidad. Los inhibidores solubles C4BP y Factor H son componentes importantes del sistema del complemento, coordinando su actividad de tal manera que limitan su acción impidiendo respuestas exacerbadas e inespecíficas que pueden resultar nocivas para el organismo. Por su parte C4BP, actúa en la vía clásica y de las lectinas, presente en el plasma sanguíneo, con una conformación polimérica, y dos subunidades diferentes, la isoforma mayoritaria α7β1, formada por siete cadenas idénticas α y una cadena β, y otra isoforma minoritaria α7β0, incrementada en estados de elevada inflamación (fase aguda). Por otro lado, FH es un regulador esencial de la vía alternativa del sistema complemento, también presente en el plasma sanguíneo y esencial para mantener el equilibrio de esta vía. FH es una glicoproteína compuesta por 20 dominios homólogos, llamados dominios CCP, y participa como cofactor de la proteína C3. Otro componente de la inmunidad innata son las células dendríticas, las cuales juegan un papel fundamental en la respuesta inmune y son nexo de unión entre la inmunidad innata y la adaptativa. En el presente estudio se abordó la caracterización funcional y molecular de C4BP β- y FH sobre células dendríticas derivadas de monocitos (MoDCs). Dichas MoDCs fueron obtenidas a partir de células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMCs) bajo estimulación con interleuquina 4 (IL-4) y Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), y maduradas con LPS. Mediante ensayos de citometría de flujo, para el análisis fenotípico de estadíos de diferenciación y maduración de MoDCs, se pudo estudiar en profundidad la actividad tolerogénica de C4BP β- y/o FH sobre MoDCs, la viabilidad y la capacidad endocítica de las mismas. Dicho estado tolerogénico de MoDCs se caracterizó por un claro perfil anti- inflamatorio y una alteración en la expresión de las moléculas co-estimuladoras, indispensables para la activación de células T. De igual modo se estableció un modelo murino de enfermedad del xeno-injerto contra el huésped (xeno-GvHD), utilizando ratones inmunodeficientes NSG (NOD scid gamma), con el objetivo de evaluar si las MoDCs convertidas en tolerogénicas con las potenciales proteínas inmunomoduladoras caracterizadas en este trabajo C4BP β- y/o FH tenían la capacidad de retrasar o mitigar la enfermedad xeno-GvHD. Así, se observó si se prolongaba la supervivencia al realizar un trasplante de éstas a animales previamente xenoinjertados con PBMCs humanas. Además, se realizaron otros ensayos funcionales que indican un claro papel inmunomodulador C4BP β- y FH. Posteriormente, se inició un análisis de expresión a nivel de genoma humano completo con el objetivo de establecer las bases moleculares de dicha inmunomodulación. Como consecuencia, los resultados obtenidos a partir de la técnica de microarrays han permitido realizar predicciones sobre las probables vías de señalización que pueden estar involucradas en la respuesta anti-inflamatoria e inmunomoduladora dependiente de estas proteínas. Aunque no se ha podido completar aún mediante análisis funcionales la implicación de las vías de señalización predichas, la información obtenida será de gran utilidad para futuros diseños experimentales que permitan dilucidar los receptores celulares y vías de señalización sobre los cuales actúan C4BP β- y FH, y para la caracterización de nuevos fármacos anti-inflamatorios e inmunomoduladores que actúen como agonistas de los receptores moleculares de C4BP β- y/o FH.

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[eng] The C4BP and Factor H (FH) complement soluble inhibitors are pivotal when this immune response is activated given their role to control and limiting the complement activity, thus protecting from unspecific recognizing potentially harmful for human health. In addition to the complement system, the dendritic cells also play a relevant role in the response of the innate immunity. They are considered as the major joint between the adaptive and innate immunities. This Ph.D. thesis aimed the functional and molecular characterization of C4BP and FH regarding their role on differentiation and maturation of monocyte-derived dendritic cells (MoDCs). The MoDCs were obtained from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) maturated with bacterial lipopolysaccharide (LPS) prior differentiation with interleukin-4 (IL4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimuli. Monitoring of MoDCs differentiation and maturation was done by flow cytometer, an approach that was essential to assess the impact of FH and C4BP on dendritic cells and the phenotype resulting. The tolerogenic status triggered by FH and C4BP on dendritic cells was characterized by an attenuated endocytic capacity, the reverting towards an anti-inflammatory cytokine profile, and the down-regulation of co-stimulating molecules indispensable for T cell activation. Furthermore, the profound effects of FH and C4BP on dendritic cells were tested in animal models using an animal model of the graft-versus-host disease (GvHD) based on NSG immunodeficient mice. It was possible to reproduce the GvHD in NSG animals using the xenograft based on estimulated and activated human dendritic cells, and simultaneously it was observed that tolerogenic dendritic cells treated with FH and C4BP, and injected in those mice as therapy, delayed the disease onset. Finally, a genome-wide expression analysis was performed in order to shed light on the molecular pathways activated as a consequence of the FH and C4BP immunomodulation. As a consequence, the results retrieved from the microarray approach have permitted to predict certain molecular pathways probable involved in the anti-inflammatory response of dendritic cells dependent of FH and C4BP. The information presented in this thesis will be useful to design future studies addressed to the characterization of the surface receptors, and signaling pathways, by which FH and C4BP induce tolerogenicity on dendritic cells as well as characterize potential agonist of such molecules for therapeutic aims.

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Actividad anti-inflamatoria e inmunomoduladora de los inhibidores solubles del complemento C4BP ß- y factor H