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Caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tejidos de rata y humanos

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Universitat de Barcelona. Departament de Farmacologia i Química Terapèutica

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[spa] Las benzodiacepinas son unos fármacos ampliamente usados en nuestros días para el tratamiento clínico de síntomas relacionados con la ansiedad, pero estos fármacos producen por otro lados efectos miorrelajantes, anticonvulsivantes e hipnóticos. Las benzodiacepinas median estos efectos a través del receptor benzodiacepínico central el cual está unido a receptor del GABA y del ionóforo del cloro. Aunque estos efectos farmacológicos están mediados a través del receptor benzodiacepínico central (Costa y col, 1979), existe otra clase de lugares de unión a las benzodiacepinas cuyo mecanismo de acción es menos claro. Estos lugares de unión se encuentran localizados tanto a nivel de tejidos periféricos (Baestrup and Squires, 1977) y en el cerebro, concretamente a nivel de la glia (Awad and Gavish, 1987, 1989). A este lugar de unión se le denomina receptor benzodiacepínico periférico, existiendo ligandos específicos para este lugar como son el Ro 5-4864 (que presenta una estructura de tipo benzodiacepínica y se diferencia del diazepam, que presenta una elevada afinidad por el receptor benzodiacepínico central, por la presencia de un cloro en posición 4') y el PK 11195 que presenta una estructura de isoquinoleínico. Los objetivos del presente trabajo han consistido en llevar a cabo un estudio a nivel molecular para la caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tracto genital de rata. Asimismo, se ha realizado un estudio para demostrar una posible interacción entre este receptor con el receptor de la testosterona y con el receptor mitocondrial de las dihidropiridinas de alta capacidad y baja afinidad. También hemos considerado de interés ver el papel que puede desempeñar el ligano endógeno propuesto para este receptor, la protoporfirina IX. Se planteó la necesidad de realizar estudios con tejido humano y más concretamente en próstata humana, debido al posible interés de este receptor como marcador de neoplasias.  En el presente trabajo se ha realizado un estudio para demostrar la existencia de un transporte de la adenosina a nivel mitocondrial y el papel que desempeñan las benzodiacepinas a nivel periférico inhibiendo dicho transporte.  2) METODOLOGÍA Los tejidos de roedores se han obtenido a partir de ratas Sprage-Dawley macho adultas de 250-275 gramos ce peso (C.E.R.J., Le Genest, Francia). Los animales fueron estabulados en condiciones estándar de temperatura y mantenidos en un ciclo de oscuridad de 12 horas. Los animales se sacrificaron y los tejidos se homogeneizaron con un Polytron. El extracto crudo mitocondrial se obtuvo por doble centrifugación a 3000 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante obtenido en este proceso se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min. Para cuantificar el contenido proteico del "pellet" obtenido se utilizó el método de Bradford, que se fundamenta en la utilización de un colorante Coomasie Brillant Blue G-250 que se une a la proteína al cabo de 2 min., formándose un complejo que se lee al espectrofotómetro a 595 nm. Los estudios de Binding se realizaron usando [(3)H]-Ro 5-4864 y [(3)H]-PK 11195. El volumen del ensayo fue de 0.250 ml incluyendo 0.125 de la preparación mitocondrial. Las muestras fueron incubadas entre 0-4ºC durante 60 min. La incubación se terminó por filtración con ayuda del vacío a través de filtros Whatman GF/B que habían sido tratados previamente con polietilenenimna. Los filtros se colocaron son viales de centelleo y se añadió "cockteil" de centelleo, determinándose la radioactividad retenida en los filtros al cabo de 24 horas. Para les estudios de transporte [(3)H] adenosina se utilizó testículo de rata realizándose los estudios a los 5 min. 3) RESULTADOS Los estudios realizados en tejido de trata muestran la existencia de un lugar de unión de elevada afinidad tanto para el Ro 5-4864 en vesícula seminal, próstata y conducto deferente como para el PK 11195 en próstata de rata. En tejido de próstata humana se observa una disminución muy patente en la afinidad del Ro 5-4864 mientras que el PK 11195 continua teniendo en humanos una afinidiad dentro de un orden nanomolar. Los estudios cinéticos vienen a confirmar la elevada afinidad del PK 11195. Estos resultados confirman que en la especie humana el receptor benzodiacepínico periférico se aleja de una estructura relacionada con la molécula benzodiacepínica para reconocer de manera selectiva una estructura de tipo isoquinoleínico. Se ha realizado un estudio comparativo entre tejido prostático de rata y humano y dentro del tejido humano se han comparado muestras control con muestras de adenoma de próstata. Se ha comprobado una mayor población de receptores benzodiacepínicos periféricos en tejido humano respecto a roedores y no se encuentran diferencias significativas entre tejido de adenoma de próstata y control, con lo cual el papel del receptor benzodiacepínico periférico como marcador de neoplasias queda en entredicho. Los estudios de competición demuestran que el PK 11195 presenta una afinidad de orden nanomolar en tejido de rata y humano, mientras que el Ro 5-4864 presenta una elevada afinidad en roedores. Se demuestra una interacción de tipo no competitivo entre los inhibidores del "carrier" ADP/ATP y el receptor benzodiacepínico periférico. Los compuestos que actúan inhibiendo el transporte de la adenosina desplazan con una afinidad dentro del orden micromolar la unión del Ro 5-4864 y del PK 11195. La protoporfirina IX presenta una afinidad dentro del orden micromolar para el receptor benzodiacepínico periférico en roedores. Se demuestra que este efecto no se realiza a través del receptor benzodiacepínico periférico.

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[eng] The clinical use of benzodiazepines is due to their specific binding to the central benzodiazepine receptor, which is linked to the GABA receptor and ion chloride channel. At present there are no clinical applications based on the interaction of drugs peripheral benzodiazepine receptor. The aim of the present study is to investigate and characterize [(3)H]-Ro 5-4864 and [(3)H]-PK 11195 binding sites in rat and humans. PK 11195 had higher affinity by the peripheral type benzodiazepine receptor than Ro 5-4854 in human prostate. In rat the affinity was in nanomolar range for this receptor. The Ro 5-4864 binding in rat was inhibited no competivively by atractyloside and alpha, beta-methylene ATP, suggesting a modulation by the ADP/ATP mitochondrial carrier. We postulate that [(3)H]-Ro 5-4864 binding sites are regulated by purine nucleotides in a allosteric fashion, a result suggesting the involvement of these binding sites in mitochondrial metabolism, which could explain why both Ro 5-4864 and PK 11195 decrease respiratory control in isolated rat kidney mitochondria. Protoporphyrin IX the most potent endogenous ligand inhibitor of [(3)H]-PK 11195 binding (Verma and Snyder, 1989) was also able to displace [(3)H]-Ro 5-4864 binding but only a micromolar concentration range. Clonazepam, a characteristic central benzodiazepine ligand, did not displace [(3)H]-binding site. Flutamide is able to displace Ro 5-4864 and PK 11195 only a micromolar concentrations. However, the slopes of competition curves not differ from unity, we have characterized an adenosine carrier in rat mitochondria. Peripheral benzodiazepines inhibited the adenosine transporter in the micromolar range.

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Tesis Doctorals - Departament - Farmacologia i Química Terapèutica

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Caracterización del receptor benzodiacepínico periférico en tejidos de rata y humanos