# name
Biosíntesi d’isoprenoides en bacteris i plantes. Aproximacions biotecnològiques

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] Els isoprenoides constitueixen una vasta família de compostos naturals que duen a terme una amplia varietat de funcions, moltes d’elles essencials, en els tres dominis de la vida. No obstant tots ells deriven d’una única molècula comú, el IPP (i el seu isòmer DMAPP) que es produeix a través de dues possibles rutes biosintètiques, la via del MEP i la via del MVA. La via MEP és la predominant en eubacteris mentre que la del MVA ho és en arqueobacteris, fongs i animals. En plantes coexisteixen les dues vies de forma compartimentalitzada. Aquesta distribució diferencial de les dues vies ha convertit la via MEP en una nova i prometedora diana per al disseny de nous antibiòtics (amb la FSM, un inhibidor específic de l’enzim DXR de la via MEP com a màxim exponent), molt necessaris en l’actualitat com a conseqüència de l’emergent resistència que han desenvolupat un gran nombre de microorganismes patògens a les drogues desenvolupades fins al moment. No obstant, tot i que el caràcter essencial dels isoprenoides fa que la seva síntesi es mantingui en tots els éssers vius la enorme plasticitat gènica, que es concentra especialment en bacteris, ha donat lloc a l’adopció d’estratègies alternatives tant a nivell d’enzims com metabòlits. Els carotenoides conformen una subfamília dintre dels isoprenoides de compostos derivats de la molècula parental de 40 carbonis, el fitoe, amb funcions que comprenen tant el metabolisme primari com el secundari. Es sintetitzen principalment en els plastidis de les plantes però també són produïts per alguns bacteris no fotosintètics i fongs. La seva creixent aplicació en la indústria ha fet molt atractiva l’aplicació de la biotecnologia per a la producció d’aquests compostos però per poder afrontar amb garanties aquest repte cal conèixer a fons els mecanismes que regulen a tots nivells la seva producció.

Al llarg d’aquest treball s’ha combinat l’estudi dels aspectes bàsics i aplicats de la síntesi d’isoprenoides amb especial èmfasi en el paper de la via del MEP i la biosíntesi de carotenoides per proposar i avaluar estratègies de millora de la seva producció tant en bacteris com en plantes. El treball ha permès testar l’us d’enzims bifuncionals per millorar simultaniàment dos passos catalítics de la ruta carotenogènica tant en sistemes bacterians com en plantes. Es va analitzar l’efecte de la fusió de LCYE i LCYB (ε-ciclasa i β-ciclasa respectivament) en expressar-la en un sistema model carotenogènic de E.coli o en plantes transgèniques d’Arabidopsis thaliana obtenint-se resultats positius en el primer cas però no en el segon. Aquesta diferència posa de manifest la major complexitat dels sistemes vegetals. En aquesta línia es va explorar el possible paper addicional de la regulació post-transcripcional en el control del flux de la via del MEP utilitzant un mutant (rif18) obtingut en base a un escrutini de resistència a la inhibició per FSM. L’estudi va posar de manifest un nivell de regulació com a resultat de la integració i coordinació de la ruta MEP amb la resta del metabolisme de la planta especialment els metabolismes del sucre i de les hormones.

Paral.lelament es va avaluar el paper que juguen individualment cada un dels enzims de la via MEP en el control del flux de la via en sistemes bacterians. L’estudi de la sobreexpressió de cada un dels gens en un sistema model carotenogènic de E.coli va posar de manifest el paper clau de DXS i la participació en menor mesura de DXR i HDR, resultats similars als descrits en Arabidopsis. Però, encara més important, va demostrar que uns nivells moderats de sobrexpressió dels enzims clau produeixen millors resultats en l’acumulació de productes finals. Complementariàment es va estudiar en profunditat el paper de HDS tant en bacteris com en plantes ja que havia estat descrit préviament com un possible punt de regulació diferencial entre els dos sistemes en base a les diferències observades en alineaments de seqüència. En cap dels dos casos un increment de l’activitat d’aquest enzim millorava l’acumulació de productes finals.

Els dos passos identificats com a claus en la ruta MEP (DXS i DXR) es van escollir com a objectius sobre els que, aprofitant la plasticitat gènica i metabòlica dels bacteris, cercar noves activitats alternatives. Per DXS es van identificar dues proteïnes de E.coli (E1-PDH i DHBPS) que en patir mutacions puntuals adquirien la capacitat de complementar la deficiència de DXS. Per identificar activitats alternatives a DXR es va analitzar la presència d’homòlegs pels 7 gens de la via MEP en els genomes seqüenciats de microorganismes. Es va identificar un grup en els que hi eren presents tots ells excepte DXR. Utilitzant el genoma de Brucella abortus es va identificar una proteïna sense homologia amb DXR (DRL) capaç de suplir-ne l’absència i que defineix una nova família de proteïnes la funció de les quals era desconeguda. La seva caracterització va mostrar que catalitza la mateixa reacció amb propietats cinètiques similars a les descrites per DXR però amb diferències significatives, com una menor eficiència catalítica o una menor sensibilitat a la inhibició per FSM. L’estudi filogènetic de la família va posar de manifest l’existència de DRL vertaderes (amb activitat DXR) que s’agrupaven en un mateix clade filogenètic i DRL falses definint a l’hora tres classes de proteïnes. La cristal.lització i resolució de l’estructura tridimensional de la proteïna DRL de Brucella abortus va permetre un estudi estructural comparatiu observant-se diferències significatives respecte DXR especialment en el reordenament del centre actiu. A partir d’aquestes diferències es va hipotetitzar, en base a modelitzacions in silico, la possibilitat d’inhibir diferencialment els dos enzims. Aquesta possibilitat es va confirmar en estudis d’inhibició in vitro amb les proteïnes DXR de E.coli, i DRL de B.abortus recombinants purificades. Els α-fenil derivats de la FSM mostraven una capacitat d’inhibició de DXR en l’ordre nanomolar mentre que no mostraven cap efecte sobre DRL a concentracions de fins a 1 mM obrint la porta al disseny de nous antibiòtics de gran especificitat.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] ISOPRENOIDS BIOSYNTHESIS IN BACTERIA AND PLANTS

Isoprenoids are a vast family of natural compounds that perform a wide variety of biological functions, many of which are essential. However, they all derived from the universal intermediates IPP and its isomer DMAPP. Their biosynthesis occurs through two possible biosynthetic routes, the MEP and the MVA pathways. The MEP pathway is the exclusive source of IPP and DMAPP in eubacteria whereas the MVA pathway provides these precursors in archaea, fungi and animals. In plants, both pathways coexist in different subcelullar compartments. This distribution of isoprenoid biosynthetic pathways among the kingdoms has turned the MEP pathway into a promising new target for the design of new antibiotics (with FSM, a specific inhibitor of the enzyme DXR, as the main representative). Although isoprenoids are essential in all free-living organisms, tremendous plasticity among bacteria has led to the evolution of alternative biochemical strategies to produce these universal precursors.

Carotenoids comprise a subfamily of C40 isoprenoid end products derived from a molecule of phytoene with functions in both primary and secondary metabolism. These are synthesized primarily in the plastids of plants but are also produced by some photosynthetic bacteria, fungi, and rarely in insects. The increasing use of carotenoids in the food, cosmetics and pharmaceutical industries as pigments, fragrances and nutraceuticals has galvanized their production through biotechnological applications. We have combined the study of basic and applied aspects of isoprenoid biosynthesis focusing on the role of the MEP pathway and carotenoid biosynthesis to suggest and evaluate strategies for improving their production in bacteria and plants. To this end, we have exploited the metabolic plasticity of bacteria to provide new biotechnological tools for carotenoid production.

In the study, the use of bifunctional enzymes was tested to simultaneously improve two catalytic steps. As a proof of concept we analyzed the effect of chimeric LCYE-LCYB (ε-cyclase and β-cyclase, respectively) in a carotenogenic E. coli model system or in transgenic plants of Arabidopsis thaliana. The difference in the results highlights the major complexity of plant systems. In this direction, we studied the possible role of additional post-transcriptional regulation controlling the flow of the MEP pathway by using a mutant (rif18) isolated from a FSM-resistance screening. The study showed a higher level of regulation as a consequence of the integration and coordination with other metabolic pathways of the plant, especially the metabolism of sugars and hormones.

We also evaluated the role of each of the individual enzymes of the MEP pathway in controlling the pathway flux in bacterial systems. Overexpresion of each individual gene in a carotenogenic E. coli model system highlighted the key role of DXS and to a lesser extent of the participation for DXR and HDR in driving flux through this pathway, in agreement with previous reports for Arabidopsis. Even more importantly, these results demonstrate that adjusted levels of overexpresion of the key enzymes produce better results in the accumulation of end products, the most relevant parameter for evaluating biotechnological strategies. Additionally, we further studied the role of HDS both in bacteria and plants. This enzyme had been previously postulated to have different regulatory roles in the two systems based on protein alignments. In both cases, an increase in enzyme activity does not affect the accumulation of end products.

The identified key steps in the MEP pathway (DXS and DXR) were chosen as targets to search for new alternative activities taking advantage of the genetic and metabolic plasticity of bacteria. Two E.coli proteins which underwent change-of-function mutations in dxs or dxr deficient strains and acquired DXS activity were identified (DHBPS and PDH-E1). An alternative activity to DXR was identified by analyzing the sequenced genomes available from bacteria. A small group of microorganism contains homologous genes for all MEP pathway but DXR. Using the genome of Brucella abortus, a separate protein with no apparent homology to DXR (thereafter named DXR-like, or DRL) was identified.

DRL defines a new family of proteins that catalyzes the first committed step of the MEP pathway. Characterization of the protein showed that it catalyzes the same reaction with similar kinetic properties as DXR albeit with significant differences in catalytic efficiency and lower sensitivity to inhibition by FSM. Phylogenetic and complementation studies of the family revealed the existence of true DRL (with DXR activity) grouped in the same phylogenetic clade.

Crystallization and structural resolution of DRL from Brucella abortus allowed a comparative study. Significant differences to DXR were observed, in particular in the arrangement of the active site. Based on those differences and in silico modeling, the possibility to selectively inhibit either enzyme was hypothesized. In vitro inhibition studies using purified recombinant E. coli DXR and B.abortus DRL demonstrates that α-phenyl derivatives of FSM inhibit DXR in the nanomolar range while show no significant effect on DRL at a concentrations up to 1 mM. Those results open the door for the design of new highly specific antibiotics.

The first tests in biotechnological applications comparing the ability of the three alternative proteins to replace the original DXS or DXR activities showed no improvement in performance. However, these proteins should be considered starting materials to continue the optimization of the new catalytic functions acquired using directed enzyme evolution methods in the laboratory.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

# metadata.dc.title[].value
Biosíntesi d’isoprenoides en bacteris i plantes. Aproximacions biotecnològiques