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The Iron Regulatory Protein/Iron Responsive Element (IRP/IRE) system: functional studies of new target mRNAs and pathological implications for novel IRE mutations

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Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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[eng] Iron is an essential micronutrient required for many cellular reactions and a tight regulation of its metabolism is therefore crucial for health. Cellular iron homeostasis relies on the coordination of iron uptake, storage and mobilization. These processes are controlled post-transcriptionally by the IRP/IRE regulatory system. The Iron Regulatory Proteins (IRP1 and IRP2) can recognize cis- regulatory mRNA motifs termed IREs (Iron Responsive Elements), conserved RNA elements located in the untranslated regions (UTR) of mRNAs that encode for proteins involved in iron metabolism. IRP/IRE interactions regulate the expression of mRNAs encoding for proteins for iron acquisition, storage, utilization and export in response to cellular iron level itself being the interaction of the IRPs with IRE motifs promoted under iron-deficient conditions and abolished in iron-replete conditions. Depending on the location of the IRE, IRPs binding regulates gene expression differentially: IRPs inhibit translation initiation when bound to IREs at the 5’ UTR, while IRPs association with 3’ IREs stabilizes and protects the mRNA from degradation. The lack of control of expression of IRE-containing mRNAs is associated in humans with pathological conditions showing the importance of components of the IRP/IRE regulatory system. In the last decades, significant progress has been made in the iron metabolism field, however, post-transcriptional regulation of gene expression by the IRP/IRE regulatory system has been limited to a small subset of known genes. A genome-wide study carried out by our group to characterize the whole repertoire of mRNAs that can interact with the IRPs, identified 35 novel IRP1 and IRP2 candidate target-genes. This work focused on the validation and functional characterization of one of this candidates: Profilin2 (Pfn2). Pfn2 is an actin-binding protein involved in the control of cytoskeletal dynamics. We identified a conserved IRE in the 3’ UTR of Pfn2 mRNA which is functional in in vitro binding studies with IRP1 and IRP2. Pfn2 mRNA showed preferentially downregulation under iron-excess condition in cell lines and we demonstrated to be regulated by IRPs-mediated stabilization in vivo, since Pfn2 mRNA levels are reduced in a mouse model with Irp1 and Irp2 gene inactivation. Moreover, the reduction of cellular free iron levels by Pfn2 overexpression experiments in cell lines, as well as, the misregulation of iron distribution observed in mice knockout for Pfn2 gene, revealed Pfn2 as a previously unrecognized player in iron metabolism. In addition, we also contributed to the identification of a functional 3’ IRE in human BDH2 mRNA, a protein involved in lipocalin-siderophores iron-trafficking, as well as, in the identification and characterization of two novel L-ferritin IRE mutations (Heidelberg +52G>C and Badalona+36C>U) causative of Hereditary Hyperferritinemia Cataract Syndrome and a novel mutation in ALAS2 IRE demonstrated to be a modifier of clinical severity in a family with Erythropoietic Protoporphyria.

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[spa] El hierro es un micronutriente esencial requerido por múltiples reacciones celulares y una regulación adecuada de su metabolismo es fundamental para la salud. La homeostasis celular del hierro está basada en la coordinación de la absorción, el almacenamiento y la movilización de este elemento. Estos procesos son controlados post-transcripcionalmente por el sistema IRP/IRE. Las proteínas reguladoras del hierro (IRP1 e IRP2) reconocen un motivo estructural presente en el ARNm de algunos genes denominado IRE (Iron Responsive Element). El IRE es un motivo conservado y situado en las regiones no traducidas (UTR) de los ARNm de proteínas implicadas en el metabolismo del hierro. Las interacciones IRP/IRE regulan la expresión de los ARNm que codifican proteínas para la adquisición, el almacenamiento, la utilización y la exportación de hierro en respuesta a los niveles celulares de hierro, porque la interacción de las IRPs con los motivos IRE se ve incrementada a niveles bajos de hierro y disminuida en condiciones altas de hierro. Según la localización de los IRE, las IRPs regulan de manera distinta la expresión de sus dianas: las IRPs inhiben la iniciación de la traducción cuando se unen a IREs situados en el 5' UTR, mientras que su asociación con los IREs del 3' UTR estabiliza y protege dicho ARNm de la degradación. La falta de coordinación de la expresión de genes que contienen IRE está asociada con condiciones patológicas ilustrando la importancia de los componentes del sistema regulador IRP/IRE. En las últimas décadas se han realizado progresos importantes en el campo del metabolismo del hierro. Sin embargo, la regulación post-transcripcional de la expresión génica por el sistema IRP/IRE se ha limitado a un pequeño subconjunto de genes. Un estudio “genome-wide” llevado a cabo en nuestro grupo para la caracterización global del sistema regulador IRP/IRE dio como resultado la identificación de 35 genes diana que se unen a IRP1 e IRP2. La presente tesis tiene como objetivo general validar y caracterizar funcionalmente una de esas dianas: Profilin2 (Pfn2). Pfn2 es una proteína que une actina y que está involucrada en la regulación de la dinámica del citoesqueleto. Hemos identificado un IRE localizado en el 3’ UTR del ARNm de Pfn2; el IRE es funcional en estudios in vitro para la unión a IRP1 e IRP2. El ARNm de Pfn2 viene preferentemente regulado y reducido en condiciones altas de hierro en líneas celulares y hemos demostrado in vivo que es regulado por estabilización mediada de las IRPs, ya que los niveles de ARNm de Pfn2 se encuentran reducidos en ratones a los que los genes de Irp1 y Irp2 han sido inactivados. Así mismo, la sobrexpresión de Pfn2 en líneas celulares asociada a una reducción en los niveles de hierro libre, así como la desregulación de la distribución del hierro encontrada en ratones “knockout” para el gen de Pfn2; convierten a Pfn2 como un actor nuevo en el metabolismo del hierro. Por otro lado hemos contribuido tanto a la identificación de un 3’ IRE funcional en el ARNm humano de BDH2, una proteína involucrada en el tráfico de hierro a través del sistema de lipocalinas-sideróforos, como a la identificación de dos nuevas mutaciones en el IRE de la Ferritina L (Heidelberg +52G>C y Badalona+36C>U) responsables del Síndrome Hereditario de Hiperferritinemia con Cataratas y también a la identificación de una nueva mutación en el IRE de ALAS2 que ha demostrado ser un modificador de la importancia clínica de los síntomas en una familia con Protoporfiria Eritropoyética.

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Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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The Iron Regulatory Protein/Iron Responsive Element (IRP/IRE) system: functional studies of new target mRNAs and pathological implications for novel IRE mutations