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New sphingolipid probes for metabolism and trafficking studies

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Universitat de Barcelona. Departament de Farmacologia i Química Terapèutica

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[eng]  To study biological systems through the specific labeling of biomolecules by chemical reactions has grown interest in the last few years. In order to perform chemical reactions in living systems, it is essential that these processes fulfill certain criteria: 1) to proceed under physiological conditions; 2) to be high yielding and show fast reaction rates; 3) to require simple reaction conditions, and 4) to be biocompatible with the myriad of functionalities within biological systems. Along this line, to incorporate an azide functionality (chemical reporter) in the biomolecule of interest allows its selective labeling through 1,3-cycloadditions with terminal (copper-catalyzed) or cyclic alkynes. Such reactions are termed as ‘click’ reactions and are very used to label a wide number of biomolecules. 

Sphingolipids (SLs), a large and diverse class of lipids, are structural components of eukaryotic cell membranes. Besides its structural roles, it has been discovered that some sphingolipids are bioactive molecules which regulate cellular responses such as proliferation, differentiation, apoptosis and cell death. Moreover, sphingolipids dynamically assemble with sterols to form lipid rafts which are intimately associated with cell signaling. All these discoveries have grown interest in the development of molecular and chemical tools to study the metabolism and localization of these molecules. 

In the present Doctoral Thesis, we designed and synthesized various sphingolipid probes, bearing an azide functionality at omega and C1 positions of sphingoid base. The sphingolipid probes possessing an azide at omega position also comprised variations at C1 and as well as different acyl chains in the amide linkage. This family of omega-azidosphingolipids turned out to be non-cytotoxic and to metabolize as natural sphingolipids in different cell lines. 

Likewise, we developed new methodologies to study sphingolipid metabolism and intracellular localization based on azide-alkyne cycloaddition reactions. First of all, we developed a new approach for the quantitative analysis of sphingolipids, based on the labeling of different populations of sphingolipids with various azadibenzocyclooctyne-derived tags through click reactions. We optimized the click reaction in cell extracts containing omega-azidosphingolipids, and next we labeled cell extracts with the various cyclooctyne tags. We were able to detect a large number of sphingolipid triazoles, arising from the click reactions, by UPLC-TOF with high sensitivity. 

Moreover, we developed a method for the labeling of omega-azidosphingolipids in live cells through the click reaction with a fluorescent dye. We first designed and prepared the fluorescent dye, based on an azadibencyclooctyne moiety linked to a fluorescein unit. We next evaluated the internalization of this dye in cell membranes, analyzing cellular fluorescence by flow cytometry. Finally, we labeled cells with the fluorescent dye, and we observed an increase of fluorescence in cells which had been pre-treated with omega-azidosphingolipids. Moreover, we nicely visualized the resulting fluorescent click adducts by confocal microscopy. 

In the last application of these sphingolipid probes, we developed a method for the visualization of fluorescent ceramides in artificial lipid membranes. We incorporated omega-azidoceramide and C1-azidoceramide probes into artificial membranes and next labeled them using a fluorogenic click reaction with a non-fluorescent naphtalimide. The resulting click adducts, which became fluorescent, were nicely visualized by confocal microscopy. This methodology might be an important approach for the localization of azidoceramides in membranes of live cells by fluorescence microscopy.

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[spa]  Los esfingolípidos son una amplia y diversa familia de lípidos, que cumplen papeles esenciales como componentes de las membranas celulares. Además, recientemente se ha descubierto que son moléculas bioactivas que actúan como mensajeros secundarios en la regulación de funciones celulares como proliferación, diferenciación, adhesión y muerte celular. Por otro lado, los esfingolípidos se asocian dinámicamente al colesterol, formando dominios lipídicos. Estos dominios están relacionados con un gran número de funciones celulares. 

Muchos procesos patológicos se pueden curar o prevenir actuando directamente sobre el metabolismo de los esfingolípidos y/o su interacción con sus dianas terapéuticas. Por este motivo, el diseño y síntesis de sondas lipídicas para el estudio del metabolismo y localización celular de estas especies es de gran interés. 

La funcionalidad azida es un chemical reporter que reacciona con alquinos terminales y cíclicos mediante cicloadiciones 1,3-dipolares. Mientras que la reacción con alquinos terminales requiere catálisis de cobre, con alquinos cíclicos no es necesaria. Estas reacciones, denominadas reacciones click, se caracterizan por ser selectivas, biocompatibles, rápidas, eficientes y, además, tienen lugar en condiciones fisiológicas. Son ampliamente utilizadas para el estudio de sistemas biológicos. 

En esta tesis doctoral, se ha diseñado y sintetizado una familia de esfingolípidos marcados (“sondas”) con una funcionalidad azida en la posición omega y C1. Se han realizado modificaciones en la posición C1 y en el enlace amida para obtener diferentes derivados. 

Con las “sondas” mencionadas previamente, se han desarrollado diferentes aplicaciones basadas en el uso de reacciones click. En primer lugar, se ha desarrollado una metodología para el análisis simultáneo de diferentes poblaciones de esfingolípidos, marcadas por reacción click con diferentes ciclooctinos. En segundo lugar, se ha diseñado y sintetizado un azadibenzociclooctino con una unidad de fluoresceína, para su uso en la conjugación de omega-esfingolípidos en células vivas. Para ello, se estudió la internalización de dicho ciclooctino fluorescente en membranas celulares, analizando cuantitativamente la fluorescencia mediante citometría de flujo. Seguidamente, células pre-tratadas con algunos de los omega-esfingolípidos fueron conjugadas con el ciclooctino fluorescente. La fluorescencia fue analizada por citometría de flujo y los omega-esfingolípidos conjugados fueron visualizados mediante microscopía confocal. Por último, también se ha desarrollado un método para la visualización de ceramidas en membranas artificiales mediante reacciones click fluorogénicas. Los aductos fluorecentes resultantes de la reacción click fueron visualizados mediante microscopía confocal.

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Tesis Doctorals - Departament - Farmacologia i Química Terapèutica

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New sphingolipid probes for metabolism and trafficking studies