# name
Aplicació de tecnologies optimitzades al diagnòstic molecular de la malaltia de von Willebrand per a l’estudi de la relació genotip-fenotip

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Departament de Genètica

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] La Malaltia de von Willebrand (VWD) és la coagulopatia congènita més freqüent a la població general. Consisteix en una diàtesi hemorràgica causada per una deficiència qualitativa i/o quantitativa del factor de von Willebrand (VWF) que es transmet amb caràcter autosòmic dominant o, menys freqüentment, recessiu. El VWF és una glicoproteïna adhesiva present en plaquetes, cèl•lules endotelials i megacariòcits que té diferents funcions donat que participa en l’hemostàsia primària i col•labora al mateix temps en la secundària. És un mediador de l’adhesió de les plaquetes al subendotel•li en el lloc de la lesió vascular i transporta al FVIII, al que protegeix de la degradació proteolítica prematura. El gen del VWF (VWF) s’extén unes 178 kilobases en el genoma i conté un total de 52 exons, sent un dels gens més grans i complexos descrits en humans. Addicionalment existeixen una sèrie de factors que dificulten de manera considerable la caracterització molecular de la VWD i que han fet que la seqüenciació directa no s’hagi considerat el mètode de referència per al seu diagnòstic. En primer lloc, el VWF és un gen altament polimòrfic i, fins al moment, s’hi han descrit 102 SNPs (Build 132) en regió codificant, el que pot dificultar la identificació de les mutacions i, en segon lloc, existeix un pseudogèn parcial al cromosoma 22 d’aproximadament 30 kb molt homòleg (>96%) als exons 23-34 del  VWF.
Amb l’objectiu de facilitar l’anàlisi genètic de la VWD, s’ha dissenyat un procediment simplificat basat en la seqüenciació completa del gen, que s’ha utilitzat per identificar la mutació en un total de 40 famílies i demostra la seva validesa com a mètode rutinari de diagnòstic molecular. Amb l’aplicació d’aquest mètode s’han identificat un total de 58 mutacions (41 diferents), 19 de las quals no s’havien descrit prèviament a la literatura. Entre els diferents tipus de mutació responsables de la VWD, aquelles que modifiquen la regió codificant del gen tenen un clar efecte deleteri, però les conseqüències de les mutacions que afecten potencialment l’splicing (PSSM) són menys evidents. Amb l’objectiu d’estudiar l’efecte d’aquestes mutacions s’ha desenvolupat un mètode per a la seqüenciació completa del cDNA del VWF en leucòcits i plaquetes que ens ha permès revelar l’efecte de diverses PSSM. 
L’aparició de les plataformes de seqüenciació de nova generació (NGS), que són fins 200 vegades més ràpides i econòmiques que la seqüenciació tradicional, ha plantejat nous reptes en el diagnòstic molecular de les malalties hereditàries. Per això s’ha desenvolupat una nova estratègia d’amplificació del gen en un total de 14 PCRs llargues i hem adaptat el procediment desenvolupat prèviament per a la seqüenciació completa del VWF a les noves plataformes de NGS. Aquestes estratègies permetran l’anàlisi simultània d’un gran nombre de mostres de pacients i familiars de manera més ràpida i econòmica que per seqüenciació tradicional. 
Amb l’objectiu de recopilar tota la informació generada a partir del diagnòstic molecular dels pacients amb VWD i fer-la accessible, hem dissenyat un nou apartat dins d’Hemobase (registre de mutacions per a les Hemofílies A i B) dedicat a la VWD (www.vwf.hemobase.com). Aquesta pàgina d’accés lliure per Internet, conté un registre de les mutacions identificades en pacients amb VWD després de la seqüenciació directa del VWF. El registre permet realitzar cerques, relacionar qualsevol mutació amb la base de dades internacional i accedir directament a les publicacions corresponents. Es pretén que l’estudi molecular dels pacients permeti una millor comprensió dels mecanismes implicats en la fisiopatologia de la malaltia i ofereixi una visió més àmplia de l’epidemiologia molecular a la nostra població.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] Von Willebrand Disease (VWD) is the most frequent congenital coagulopathy in the general population. It has been proved to be particularly complex due to a series of factors that make difficult the molecular diagnostic of the disease: the von Willebrand Factor gene (VWF) is large and complex; it is very polymorphic; there is a partial pseudogene in chromosome 22 highly homologous (>96%) to a region of the VWF; and the existence of other genes implied in the disease cannot be discarded. All this set of difficulties causes that the molecular study of the VWD remains confined to basic investigation and the application to the clinical routine has been considerably delayed. 
With the aim to facilitate the genetic study of the VWD, we designed and optimized a procedure for direct sequencing of the VWF, that allowed us to study 40 families identifying 58 mutations (41 different), 19 of which were new. Among the different types of mutation that cause VWD, those affecting the coding region have frequently a clear deleterious effect; however, the consequences of the potential splice site mutations (PSSM) are less predictable. A method for the complete sequencing of the VWF cDNA in leukocytes and platelets has been developed allowing the elucidation of the effect of several PSSM studied. 
Next Generation Sequencing (NGS) platforms are faster and cheaper that the traditional sequencing. In order to take advantage of this new technology, we have developed an optimized strategy for the amplification of the VWF by LR-PCRs and we have tailored the previously developed short PCR procedure. The objective is to achieve high performance in the molecular characterization of VWD patients and relatives and to establish the basis for a large-scale molecular study approach. Finally, a database of the mutations identified, responsible for the pathology (www.vwf.hemobase.com), has been established in order to correlate molecular and clinical parameters. The development of suitable tools for the molecular diagnosis of VWD will significantly facilitate the clinical diagnosis and will guide the clinician towards the better therapeutic option.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Departament - Genètica

# metadata.dc.title[].value
Aplicació de tecnologies optimitzades al diagnòstic molecular de la malaltia de von Willebrand per a l’estudi de la relació genotip-fenotip