# name
CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Departament de Genètica

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] La Retinosi Pigmentària (RP), la causa de ceguesa més freqüent en adults (1:4000), està originada per mutacions en més de 50 gens. Un d’aquests és CERKL, gen identificat l’any 2004 pel grup, l’estudi funcional del qual constitueix el tema d’aquesta Tesi Doctoral. Fins el moment, s’han descrit vàries mutacions en CERKL causants d’RP o de distròfia de cons i bastons (CRD). A nivell proteic, CERKL presenta un 50% de similitud amb la proteïna quinasa de ceramides (CERK) i comparteix el domini diacilglicerol quinasa (DAGK). Endemés, CERKL presenta diferents dominis proteics coneguts (senyals de localització (NLS) i d’exportació (NES) nuclear, així com un domini d’homologia a plextrina (PH)). Tot i que s’han identificat mutacions que indubtablement causen degeneració retinal, encara resta per descriure la seva funció fisiològica, així com la seva contribució a la patologia.
  
L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la caracterització funcional del gen i la proteïna CERKL a partir d’assaigs in vitro, combinant estratègies in silico, cel•lulars i moleculars, profunditzant en les anàlisis quantitatives i qualitatives dels principals esfingolípids. Finalment, també s’ha construït i analitzat un model animal murí knockout, Cerkl -/-.

Els principals resultats obtinguts en aquest treball s’enumeren a continuació:

1.- A nivell transcripcional, s’han caracteritzat de forma exhaustiva les isoformes produïdes per CERKL en retina humana i murina, revelant un nivell de complexitat inesperat, amb més de 20 isoformes, degudes principalment a empalmament alternatiu, així com a la presència de, com a mínim, quatre promotors diferents amb especificitat tissular.

2.- Estudis cel•lulars de sobreexpressió mostren que CERKL exerceix un efecte protector davant l’apoptosi causada per estrès oxidatiu, mentre que les formes mutants no retenen aquesta funció. Encara que els mecanismes de protecció es desconeixen, aquests resultats apunten a una funció neuroprotectora a curt termini de CERKL als fotoreceptors, els quals estan sotmesos de manera continuada a estrès lumínic i oxidatiu.

3.- Estudis exhaustius i detallats mitjançant tècniques de TLC, HPLC i UPLC per l’anàlisi de lípids han demostrat que CERKL no fosforila les ceramides ni cap dels esfingolípids identificats fins el moment, sota les condicions utilitzades. Tampoc s’ha pogut observar una funció quinasa de proteïnes. Els resultats obtinguts en aquest treball apunten a que CERKL ha d’exercir una altra funció a la cèl•lula, molt probablement lligada al transport de lípids o a la regulació d’altres processos cel•lulars.

4.- La localització subcel•lular ha determinat que CERKL localitza, principalment, al reticle endoplasmàtic i a l’aparell de Golgi i, de manera minoritària, al nucli, mostrant una localització extremadament dinàmica que recolza la contribució de CERKL en processos de transport i senyalització, així com una multiplicitat funcional.

5.- Un dels aspectes claus d’aquesta Tesi ha estat el disseny, generació i estudi fenotípic a nivell transcripcional, cel•lular, morfològic, electroretinogràfic i lipidòmic del model animal Cerkl-/-. El ratolí Cerkl-/- és viable i fèrtil, i els nostres estudis preliminars no mostren una degeneració de retina severa. El fenotip dels ratolins KO mostra una alteració significativa i consistent dels potencials oscil•latoris als electroretinogrames, els quals indiquen una afectació de les cèl•lules ganglionars i/o amacrines. Aquestes dades concorden amb les anàlisis immunohistoquímiques i d’hibridació in situ en retines de ratolí WT i KO, on la màxima expressió de CERKL es detecta en les cèl•lules ganglionars, i de manera més moderada, en la capa nuclear interna i fotoreceptors. 

En resum, CERKL és un gen que mostra una gran complexitat transcripcional i funcional. Els pròxims objectius abordaran l’estudi en detall del model animal generat, així com d’altres models en vies de construcció.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] The main aim of this thesis was the transcriptional and functional characterisation of CERKL, one of the many genes described so far that are responsible for Retinitis Pigmentosa (RP), the main genetic cause of blindness in adults (prevalence 1:4.000). In particular, we aimed to: i) characterise the complex CERKL transcription in human and mouse retinas, ii) analyse the subcellular localisation of the CERKL encoded proteins, including the truncated isoform R257X, generated by the most frequent mutant allele; iii) characterise the substrate and possible enzymatic role of the CERKL protein; iv) describe the role of CERKL in the protection against oxidative stress; and last but not least, v) design, create and initially characterise a mouse Cerkl-/- model (knockout) at the transcriptional, histological, immunohistochemical and lipidomic levels, focussing on the retina.
Our results showed a high transcriptional complexity of the CERKL gene in the human and murine retina, with an extremely dynamic subcellular localisation, indicating the possibility of different functional roles in each compartment. The overexpression of CERKL protects cells from induced oxidative stress, suggesting that CERKL might play an important role in the initial response against oxidative injuries. CERKL harbours a conserved lipid kinase domain and the high homology with CERK has suggested a possible involvement in the sphingolipid metabolism. However, up to date, no kinase activity has been detected and the CERKL function remains unclear. In order to elucidate the CERKL physiological function, study its role in the retina, and whether it is (or not) related to sphingolipid metabolism, a knockout mouse was generated. The murine model resulted in a knockdown more than a knockout model, as alternative previously unreported promoters directed basal expression of Cerkl. Initial characterisation of the animal model phenotype showed a consistent and non-progressive alteration of the oscillatory potentials in the electroretinograms, an increase of apoptosis and GFAP protein (gliosis marker), as well as a decrease in Brn3a protein (ganglion cell marker), although no gross morphological changes were detectable. All together, these results point to clear signs of functional alteration at the ganglion cell layer. To determine the CERKL involvement in the sphingolipid metabolism, lipidomic quantification was performed and the analyses of the results are currently in progress.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Departament - Genètica

# metadata.dc.subject.other[].value
Ocular manifestations of general diseases

# metadata.dc.title[].value
CERKL, generació d’un model knockout de retinosi pigmentària i estudis funcionals