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Estudio de los mecanismos de inhibición de la actividad carnitina palmitoiltransferasa I

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[spa] La obesidad y la diabetes tipo 2 son patologias en las cuales se ha demostrado una desregulación del metabolismo de ácidos grasos. Una acumulación de lípidos en otros tejidos distintos del tejido adiposo, entre los que sobresalen el músculo, páncreas e hígado conduce a la aparición de la resistencia a la insulina en el músculo, una secreción incontrolada de insulina en el páncreas y al desarollo de una esteatosis hepática. Estas enfermedades apuntan a la importancia del metabolismo de los ácidos grasos. Los ácidos grasos se oxidan mayoritariamente en mitocondrias y peroxisomas y este paso está facilitado por las carnitina acitransferasas. En esta tesis estudiaremos un miembro de esta familia, la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). CPT1 es un enzima que facilita el transporte de ácidos grasos de cadena larga a la matriz mitocondrial, donde serán oxidados. Este proceso esta regulado por malonil-CoA, el inhibidor fisiológico de CPT1. El objetivo de este trabajo es identificar mediante análisis bioinformáticos y cinéticos la ubicación del malonil-CoA en las isoformas hepática y muscular de CPT1 (CPT1A y CPT1B). Con un buen modelo malonil-CoA/CPT1 se podrían diseñar fármacos para regular la β-oxidación de algunos ácidos grasos como palmitato y oleato, ya que sus niveles están estrechamente relacionados con patologías como la obesidad y la diabetes tipo 2. Aún no se ha resuelto el cristal de CPT1, posiblemente por ser una proteína integral de membrana. Por ello hemos recurrido a una aproximación bioinformática y análisis de "Docking" in silico, como método predictivo de las posibles interacciones de malonil-CoA con CPT1. El modelo 3D obtenido presenta dos sitios de unión de malonil-CoA, situados de forma opuesta en el canal catalítico, sitio A y sitio O. La validez de este modelo de "Docking" ha sido confirmada mediante estudio cinético de competición del inhibidor con los sustratos de CPT1A, carnitina y palmitoil-CoA y también mediante análisis de mutantes de CPT1A. Malonil-CoA es un inhibidor competitivo de CPT1 respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor mixto lineal de CPT1A respecto a la carnitina. Estos datos están de acuerdo con el modelo 3D propuesto de interacción de malonil-CoA, carnitina y palmitoil-CoA. En este trabajo proponemos por vez primera un modelo 3D de la isoforma muscular, CPT1B que ha resultado muy similar, como era de esperar, al de la isoforma hepática. Mediante estudios de mutagénesis dirigida hemos confirmado la ubicación de los residuos catalíticos y de un residuo implicado en la sensibilidad a malonil-CoA. Diversos estudios presentan al enzima CPT1 como potencial diana para el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. También el enzima ácido graso sintasa (FAS) se ha propuesto como diana para el tratamiento de la obesidad. En este trabajo hemos demostrado que C75, una lactona ciclica de origen sintético, no solo actúa sobre FAS sino también sobre CPT1 y hemos aportado nueva información sobre el mecanismo de acción de esta molécula sobre la actividad CPT1 in vitro e in vivo. Los análisis por MALDI-TOF y HPLC-MS/MS y los estudios cinéticos y estructurales confirman que C75 es transformado in vitro e in vivo en su derivado CoA, el C75-CoA y bajo esta forma actúa como un inhibidor potente y reversible de CPT1. Además C75-CoA es un inhibidor competitivo respecto al sustrato palmitoil-CoA y es un inhibidor competitivo mixto respecto al sustrato carnitina. Los resultados del análisis de Docking de una molécula de C75-CoA en CPT1A confirman los resultados cinéticos obtenidos. Este estudio abre las puertas para el diseño de nuevos fármacos basados en la molécula de C75.

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[eng]  Carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) is an ezyme that facilitates the transport of long chain fatty acids into the mitochondrial matrix for their oxidation. This process is regulated by malonyl-CoA, the physiological inhibitor of CPT1. The aim of this work is to identify by biocomputing and kinetic analyses the location of malonyl-CoA in the hepatic and muscular isoforms of CPT1 (CPT1A and CPT1B). The use of a good structural model of malonyl-CoA/CPT1 interaction might be useful for the design of drugs to control the regulation of β-oxidation of some fatty acids as palmitate and oleate, since their levels are closly linked whith pathologies such as obesity and diabetes type 2. Herein we propose a 3D model for CPT1 that presents two different binding sites for malonyl-CoA, situated in opposite sides in the catalytic channel, as shown by molecular Docking analisis. The validity of this Docking has been confirmed by competition kinetics studies of malonyl-CoA with both CPT1A substrates, carnitine and palmitoyl-CoA and also by analysis of specific CPT1A mutants. Malonil-CoA is a competitive inhibitor and a mixed linear inhibitor of CPT1 with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. These data are in accordance with the 3D model proposed for the interactions of these molecules with CPT1. Several studies reported that CPT1 is a potential target for the treatment of obesity and type 2 diabetes. Here we show that C75, a synthetic inhibitor of the fatty acid synthase (FAS) not only acts on this enzyme but also on CPT1. We have given new information about the mechanism of action of C75 on CPT1 activity in vitro and in vivo. MALDI-TOF and HPLC-MS/MS analyses and kinetic and structural studies confirm that C75 is transformed in vitro and in vivo in its CoA derivative, C75-CoA and under this form acts as a powerful and reversible inhibitor of CPT1. Also, C75-CoA is a competitive inhibitor and a competitive mixed inhibitor with regard to palmitoyl-CoA and carnitine respectively. The Docking analysis of C75-CoA in CPT1A confirm the kinetic results obtained. This study gives more informations for the design of new medicines based on the C75 molecule.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Estudio de los mecanismos de inhibición de la actividad carnitina palmitoiltransferasa I