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Microphthalmia-associated Transcription Factor function and regulation in KIT oncogenic pathologies

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Universitat de Barcelona. Departament de Biomedicina

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[eng] KIT (CD117) is a tyrosine kinase receptor expressed in hematopoietic progenitors, melanocytes, germ cells, mast cells, and interstitial cells of Cajal (ICC) of the digestive tract. KIT gain-of-function mutations have been associated with gastrointestinal stromal tumors (GIST) and mastocytosis (excessive accumulation of mast cells in tissues). Our group previously reported that silencing of the adapter molecule SH3BP2 led to reduced cell viability, induction of apoptosis, and decreased tumor growth in oncogenic KIT cell lines: HMC-1 (model cell of mastocytosis) and GIST cell lines. The underlying molecular mechanism was a reduction in KIT expression at the transcriptional level and a reduction in microphthalmia-associated transcription factor (MITF) at the post- transcriptional level; suggesting that SH3BP2 silencing could act by regulating miRNAs and thus affect MITF expression.
MITF plays an essential role in mast cell differentiation, and alterations in its activity have been widely studied in melanoma, but its involvement in GIST is unknown.
In this thesis, we try to elucidate the apoptotic mechanism of the absence of SH3BP2 and the implication of MITF in oncogenic KIT diseases.
First, a miRNA array was performed on GIST cell lines where SH3BP2 was silenced. The subsequent analysis determined four miRNAs, among the most abundant found, that could regulate MITF. Of these, only miR-1246 and miR-5100 were validated, and their overexpression reduced the cell viability of various GIST cell lines. These miRNAs affected MITF and MITF- dependent targets: BCL2 and CDK2 and also ETV1, a transcription factor essential for tumorigenesis in GIST.
The expression of MITF and its isoforms in GIST cell lines and patients and the functional effects of its silencing with shRNAs and inhibition of its activity with the inhibitor ML329 in GIST cell lines were analyzed. The results showed that the MITF-A isoform is preferential, and the silencing and inhibition of MITF reduces cell survival, proliferation, and tumor growth in vivo.
Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-seq) of MITF in various GIST lines identified new targets of MITF in processes such as lysosome and endolysosome biogenesis, autophagy, and mTOR signaling pathway in GIST. Overexpression of MITF induced an increase in autophagy, measured by the increase in LC3II, and the silencing of MITF affected the formation of autophagosomes and autolysosomes, indicators of the flow of autophagy. These results point to MITF as a molecule involved in autophagy, a process related to tumor aggressiveness and pharmacological resistance. On the other hand, the separation and proteomic analysis of the extracellular vesicles (EVs) secreted in GIST lines after MITF silencing showed the decreased expression of a set of proteins, including KIT. The secretion of KIT in EVs has been related to tumor expansion and metastasis in GIST.
Transcriptome analysis of GIST after MITF silencing identified alterations in genes that regulate critical pathways in the cell cycle, apoptosis, tumor growth, and metastasis.
The study of silencing and inhibition of MITF in HMC-1 (cell model of mastocytosis) yielded similar results affecting cell proliferation and viability.
Altogether we can conclude that the expression and function of MITF are essential in cell survival, proliferation, and tumorigenesis in cellular models of oncogenic KIT.

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[spa] KIT (CD117), es un receptor tirosina quinasa, expresado en progenitores hematopoyéticos, melanocitos, células germinales, mastocitos y células intersticiales de Cajal (ICC) del tracto digestivo. Mutaciones de ganancia de función de KIT han sido asociadas a tumores estromales gastrointestinales (GIST) y mastocitosis (acumulación excesiva de mastocitos en tejidos). Previamente nuestro grupo publicó que el silenciamiento de la molécula adaptadora SH3BP2 en líneas celulares de KIT oncogénico: HMC-1 (modelo celular de mastocitosis) y GIST conducía a una reducción de la viabilidad celular, inducción de apoptosis y reducción del crecimiento tumoral in vivo en modelos murinos de xenotransplante. El mecanismo molecular subyacente era una reducción de la expresión de KIT a nivel transcripcional, y una reducción del factor de transcripción asociado a microphthalmia (MITF) a nivel postranscripcional; sugiriendo que el silenciamiento de SH3BP2 podría actuar regulando miRNAs y así afectar la expresión de MITF. MITF juega un papel esencial en la diferenciación mastocitaria y alteraciones de su actividad están ampliamente estudiadas en melanoma pero se desconoce su implicación en GIST.

En esta tesis intentamos elucidar el mecanismo apoptótico de la ausencia de SH3BP2 y la implicación de MITF en enfermedades de KIT oncogénico.

Primeramente se llevó a cabo un array de miRNA en líneas celulares de GIST donde se silenció SH3BP2. El posterior análisis determinó cuatro miRNAs, entre los más abundantes encontrados, que podían regular MITF. De estos sólo miR-1246 y miR-5100 fueron validados y su sobreexpresión redujo la viabilidad celular de diversas líneas celulares de GIST. Estos miRNAs afectaron MITF y dianas dependientes de MITF: BCL2 y CDK2 y también ETV1, un factor de transcripción esencial para la tumorigenésis en GIST.

Se analizó la expresión de MITF y sus isoformas en líneas celulares y pacientes de GIST y los efectos funcionales de su silenciamiento con shRNAs e inhibición de su actividad con el inhibidor ML329 en líneas celulares de GIST. Los resultados mostraron que la isoforma MITF-A es la preferente y el silenciamiento y la inhibición de MITF reduce la supervivencia y proliferación celular y el crecimiento tumoral in vivo.

Los resultados de Secuenciación de Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP-seq) de MITF en diversas líneas de GIST identificaron nuevas dianas de MITF en procesos como biogénesis de lisosomas y endolisosomas y en la vía de señalización de mTOR y autofagia en GIST. La sobreexpresión de MITF indujo un incremento de la autofagia, medida por el incremento de LC3II y, el silenciamiento de MITF afectó la formación de auto-fagosomas y auto-lisosomas que son indicadores del flujo de autofagia. Estos resultados apuntan a MITF como molécula involucrada en autofagia, proceso relacionado con la agresividad y resistencia farmacológica de tumores. Por otro lado, la separación y análisis proteómico de las vesículas extracelulares (EVs) secretadas en líneas de GIST después del silenciamiento de MITF demostró la disminución de expresión de un conjunto de proteínas entre ellas KIT. La secreción de KIT oncogénico en EVs se ha relacionado con expansión del tumor y metástasis.

El análisis de transcriptoma de GIST después del silenciamiento de MITF identificó alteraciones en genes que regulan vías fundamentales en ciclo celular, apoptosis, crecimiento tumoral y metástasis.

El estudio de silenciamiento e inhibición de MITF en HMC-1 (modelo celular de mastocitosis) rindió resultados similares en la afectación de la proliferación y viabilidad celular.

En conjunto podemos concluir que la expresión y función de MITF es clave en la supervivencia, proliferación celular y tumorigénesis en modelos celulares de KIT oncogénico.

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Tesis Doctorals - Departament - Biomedicina

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Microphthalmia-associated Transcription Factor function and regulation in KIT oncogenic pathologies