# name
Optimization of therapeutic options against multidrug resistant microorganisms

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] Antibiotic resistance has become a public health concern. Combining antibiotics is a strategy to overcome the limited therapeutic options against multidrug-resistant bacteria, including extensively-drug resistant (XDR) Pseudomonas aeruginosa and carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae (CP-KP). Time-kill curves (TK) are used to study antibiotic combinations, but the colony count method to obtain the results is time-consuming. A bioluminescent ATP assay to analyze the results of TKs would allow the implementation of studies of antibiotic combination in clinical microbiology laboratories. The combination of meropenem and amikacin is commonly used to empirically treat infections caused by Gram-negative bacilli, but the time of amikacin administration is not well stablished. Simultaneous and staggered schedules of this combination may have different clinical impacts.

The main aims of this study were 1) to standardize and evaluate an ATP assay as an alternative to the conventional colony count method in TK studies of antibiotic combinations, and 2) to determine the optimal dosing schedule of meropenem plus amikacin against XDR P. aeruginosa and CP-KP by means of TK experiments.

The ATP assay was performed using the GloMax®96 Microplate Luminometer (Promega) that measures bioluminescence in relative light units (RLU). Background, linearity and detection limit were determined to standardize this assay. Twenty-four-hour TKs were performed, and results were analyzed in parallel using the conventional cell count method and the ATP assay. The conventional method was used as gold standard to establish the breakpoints in the ATP method. Standardization was performed with P. aeruginosa, K. pneumoniae and Enterococcus faecium.

Different dosing schedules of meropenem (MEM) and amikacin (AK) were tested against seven XDR P. aeruginosa and five CP-KP clinical isolates by 24-hour TKs. The antibiotic concentrations AK8 (8.17 mg/L) and MEM17 (17.71 mg/L) were assessed against all isolates. A higher dose of MEM32 (32 mg/L) was also assessed on all CP-KP isolates and four selected P. aeruginosa isolates with different mechanisms of resistance. A higher concentration of AK40 (40 mg/L) was evaluated against four P. aeruginosa with different amikacin minimum inhibitory concentrations (MIC), and against the two high-level amikacin-resistant CP-KP. Simultaneous schedules included both antibiotics at the start of the curve. In staggered schedules the second antibiotic was added two hours after the first antibiotic: AK after meropenem or conversely. Viable cell count (log CFU/ mL) was analysed at different times. The initial bacterial load reduction was evaluated for each dosing schedule.

Neutral saline solution (NSS) showed wider linearity and a lower detection limit than Cation-adjusted Mueller Hinton (CA-MH) in the ATP assay. Therefore, NSS was established as washing/dilution medium. Relative light forming units (RLU) signal correlated with colony forming units (CFU) when the assay was performed within the linear range. Categorization of the pharmacodynamic parameters using the ATP assay was equivalent to the colony-count method in the TKs. The bactericidal effect and synergy breakpoints were 1.348 (sensitivity 93%, specificity 78.5%) and 0.9 (98% sensitivity, 88% specificity) log RLU/ml for P. aeruginosa, and 0.764 (sensitivity 100%, specificity 76%) and 2.95 (78.6% sensitivity, 100% specificity) log RLU/ml for K. pneumoniae, respectively.

Simultaneous schedules of amikacin and meropenem caused an initial bacterial load reduction in most of the XDR P. aeruginosa and CP-KP isolates. Staggered schedules caused an initial bacterial load reduction when the concentration of the first antibiotic was above the MIC, regardless of the mechanism of resistance.

Summing up, the ATP assay was useful to determine the effectiveness of antibiotic combinations in TKs. This method, less laborious and faster than the colony count method, could be more easily performed in clinical microbiology laboratories. According to our results, simultaneous dosing schedules of amikacin and meropenem should be of choice in empirical treatments when the antibiotic susceptibility results of the infectious agent are unknown.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] L’increment de la resistència als antibiòtics representa un greu problema de salut pública a escala global. Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae són dues de les espècies involucrades amb més freqüència en infeccions nosocomials, sovint causades per soques multiresistents. Les combinacions d’antibiòtics són una de les opcions terapèutiques disponibles per a combatre infeccions causades per bacteris multiresistents. La corba de letalitat (time-kill, TK) és un mètode in vitro que permet estudiar l’activitat de les combinacions d’antibiòtics al llarg d’un temps determinat. El recompte d’unitats formadores de colònies (UFC) és el mètode tradicional d’obtenció de resultats en les TK. La possibilitat d’emprar una tècnica de bioluminescència basada en l’ATP suposaria una alternativa més ràpida i menys laboriosa que el recompte convencional. Una de les combinacions d’antibiòtics utilitzades habitualment per tractar de manera empírica infeccions causades per bacils gramnegatius és meropenem i amikacina. No obstant, l’instant d’administració de l’amikacina no està ben definit a la pràctica clínica. Els règims simultanis i esglaonats d’aquesta combinació podrien tenir diferents impactes clínics.

L’objectiu principal d’aquest estudi va ser 1) estandarditzar i avaluar una tècnica d’ATP com alternativa al mètode convencional de recompte de colònies en estudis de combinacions d’antibiòtics mitjançant TK i, 2) determinar el règim d’administració òptim de meropenem i amikacina contra P. aeruginosa extremadament resistents (XDR) i K. pneumoniae productores de carbapenemases (CP-KP) mitjançant experiments TK.

La tècnica d’ATP es va realitzar amb el GloMax®96 Microplate Luminometer (Promega), que mesura la bioluminescència en unitats relatives de llum (RLU). Per estandarditzar la tècnica, es va determinar el background, la linealitat i el límit de detecció. Es van dur a terme TKs de 24 h, i els resultats es van analitzar en paral·lel mitjançant el mètode convencional de recompte de cèl·lules i la tècnica d’ATP. El mètode convencional es va utilitzar com a gold standard per establir els punts de tall en el mètode d’ATP. L’estandardització es va fer amb P. aeruginosa, K. pneumoniae i Enterococcus faecium. La solució salina neutra (NSS) es va establir com a medi de rentat i/o dilució ja que va mostrar una major linealitat i un límit de detecció més baix que el medi de cultiu amb cations ajustats Mueller Hinton (CA-MH). Les RLU van correlacionar amb les UFC dins del rang lineal. La categorització dels paràmetres farmacodinàmics utilitzant la tècnica d’ATP va ser equivalent al mètode de recompte de colònies. Els punts de tall per a l’efecte bactericida i la sinergia van ser de 1,348 log RLU/mL (93% sensibilitat, 78.5% especificitat) i 0,9 log RLU/mL (95% de sensibilitat, 88% d’especificitat) per a
P. aeruginosa, i de 0,764 log RLU/mL (sensibilitat del 100%, especificitat del 76%) i 2,95 log RLU/mL (78.6% de sensibilitat, 100% d’especificitat) per a K. pneumoniae, respectivament.

Diferents règims d’administració de meropenem (MEM) i amikacina (AK) es van evaluar en set soques clíniques de XDR P. aeruginosa i en cinc aïllats clínics de CP-KP mitjançant TKs de 24 h. Les concentracions d’antibiòtics utilitzades van correspondre a AK8 (8,17 mg/L) i MEM17 (17,71 mg/L). També es va avaluar una concentració més elevada de MEM32 (32 mg/L) en tots els aïllats de CP-KP i en quatre soques seleccionades de P. aeruginosa amb diferents mecanismes de resistència. Es va testar una concentració més alta d’AK40 (40 mg/L) en quatre soques de P. aeruginosa amb diferents concentracions mínimes inhibitòries (CMI) d’aquest antibiòtic i en dues CP-KP amb resistència d’alt nivell a AK. Ambdós antibiòtics es van administrar alhora a l’inici de la corba en els règims simultanis. En els règims esglaonats, el segon antibiòtic es va afegir 2 hores després del primer, AK després de MEM o viceversa. El recompte de cèl·lules viables (log UFC/mL) es va analitzar a diferents temps al llarg de la corba.

Els règims simultanis d’amikacina i meropenem van causar una reducció inicial de la càrrega bacteriana a la majoria dels aïllats de XDR P. aeruginosa i CP-KP. Els règims esglaonats van causar una reducció inicial de la càrrega bacteriana quan la concentració del primer antibiòtic va ser superior a la CMI d’aquell antibiòtic, independentment del mecanisme de resistència.

En conclusió, l’assaig d’ATP va ser útil per avaluar les combinacions d’antibiòtics mitjançant experiments TK. Aquest mètode, menys laboriós i més ràpid que el mètode de recompte de colònies, podria ser fàcilment implementat en laboratoris de microbiologia clínica. Els nostres resultats suggereixen que l’administració simultània d’amikacina i meropenem hauria de ser la primera opció en els tractaments empírics per tal de buscar una major reducció inicial de la càrrega bacteriana quan es desconeix la sensibilitat de l’agent infecciós a aquells antibiòtics.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

# metadata.dc.title[].value
Optimization of therapeutic options against multidrug resistant microorganisms