# name
Comportament funcional heterogeni de les mutacions "missense" a l'extrem N-terminal de CFTR

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] La Fibrosi Quística (FQ; MIM# 219700) és una de les malalties letals més comuns en les poblacions d'origen caucàsic, amb herència autosòmica recessiva. El seu fenotip clínic es caracteritza per l'acumulació de moc viscós en òrgans exocrins, amb conseqüències patològiques en el tracte respiratori, gastrointestinal i urogenital. Mutacions al gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ABCC7; MIM# 602421) són responsables de la malaltia. Fins al moment, ja s'han descrit més de 1600 mutacions en el gen CFTR. La gran majoria són mutacions puntuals de les quals: 42% són mutacions de sentit erroni (missense). El gen CFTR codifica per una proteïna de membrana de 1480 aminoàcids, que pertany a la gran família dels transportadors ABC. La proteïna CFTR presenta una estructura simètrica, formada per dos motius repetits, cadascun d'ells format per una regió transmembrana (TMD), composada per sis α-hèlix, i una regió citosòlica hidrofílica d'unió a ATP (NBD). Aquests dos motius queden units mitjançant un domini regulador (R), citosòlic i hidrofílic, que és fosforila per PKA i PKC. El paper principal que desenvolupa el canal CFTR en la part apical de les cèl·lules epitelials és el transport de fluid transepitelial i electròlits a través de la membrana, activitat que ve regulada directament per la fosforilació de PKA. Aquest canal permet el trànsit d'ions de clorur a través d'ell en qualsevol direcció, i es caracteritza per tenir una baixa conductància unitària (la seva conductància és de 7-10 pS). Existeixen moltes evidències en la literatura on les mutacions de sentit erroni, independentment de la seva localització en el gen CFTR, poden afectar a la funció del canal CFTR a diferents nivells: biogènesi de la proteïna, transport i localització, propietats electrofisiològiques del canal. Així que l'objectiu general de la tesi va ser l'anàlisi molecular i funcional de vuit mutacions amb sentit erroni (p.P5L, p.S50P, p.E60K, p.R75Q, p.G85E, p.G85V, p.Y89C, p.E92K) localitzades en la regió N-terminal de CFTR, i identificades majoritàriament a la població espanyola. Per portar a terme els objectius de la tesi, es van generar les vuit mutacions per mutagènesi dirigida en el vector pCMVCFTRNot6.2wt, i es van expressar en cèl·lules epitelials HEK293. Es va analitzar el processament i patró de maduració de les proteïnes mutants per Western blot i la seva localització cel·lular per immunocitoquímica. I posteriorment, es van caracteritzar funcionalment els canals mutants mitjançant la tècnica de Patch clamp en configuració whole cell i excised inside-out. Vam observar que cinc de les mutacions analitzades, p.S50P, p.E60K, p.G85E, p.G85V i p.E92K, provoquen un processament i una maduració incorrecte de la proteïna. Totes cinc presenten un comportament molt similar a la mutació p.F508del, podent-se classificar aquestes mutacions dins la classe II. La mutació p.P5L afecta a la funció de CFTR a dos nivells: a nivell de la biogènesi i a nivell de l'activitat del canal. Aquesta mutació provoca una disminució de la densitat de canals a la membrana citoplasmàtica. La conductància i la cinètica del canal també s'alteren. La proteïna mutant p.Y89C afecta a l'activitat del canal. Aquesta mutació altera específicament la cinètica del canal. El canal CFTR corresponent a la mutació p.R75Q presenta un patró de maduració i un comportament funcional del canal anàleg a la proteïna CFTR no mutada. Els nostres estudis corroboren la classificació de p.R75Q com a mutació sense expressió clínica. El comportament sever de la majoria de les mutacions avaluades, afectant la biogènesi i/o l'activitat del canal, ressalta la importància funcional de la cua N-terminal i del segment TM1 en la fisiologia de CFTR.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] Over 1,600 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene sequence variations have been identified in patients with cystic fibrosis (CF) and related disorders involving an impaired function of the CFTR chloride channel. However, detailed structure-function analyses have only been established for a few of them. This study aimed evaluating the impact of eight N-terminus CFTR natural missense changes on channel behavior. By site-directed mutagenesis, we generated four CFTR variants in the N-terminal cytoplasmic tail (p.P5L, p.S50P, p.E60K, and p.R75Q) and four in the first transmembrane segment of membrane-spanning domain 1 (p.G85E/V, p.Y89C, and p.E92K). Immunoblot analysis revealed that p.S50P, p.E60K, p.G85E/V, and p.E92K produced only core-glycosylated proteins. Immunofluorescence and whole cell patch-clamp confirmed intracellular retention, thus reflecting a defect of CFTR folding and/or trafficking. In contrast, both p.R75Q and p.Y89C had a glycosylation pattern and a subcellular distribution comparable to the wild-type CFTR, while the percentage of mature p.P5L was considerably reduced, suggesting a major biogenesis flaw on this channel. Nevertheless, whole-cell chloride currents were recorded for all three variants. Single-channel patch-clamp analyses revealed that the channel activity of p.R75Q appeared similar to that of the wild-type CFTR, while both p.P5L and p.Y89C channels displayed abnormal gating. Overall, our results predict a major impact of the CFTR missense variants analyzed, except p.R75Q, on the CF phenotype and highlight the importance of the CFTR N-terminus on channel physiology.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Departament - Biologia Cel·lular i Anatomia Patològica

# metadata.dc.title[].value
Comportament funcional heterogeni de les mutacions "missense" a l'extrem N-terminal de CFTR