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Descripción de biomarcadores diagnósticos en formas de alto riesgo de cáncer colorrectal y desarrollo de un modelo in vitro para la evaluación de la respuesta a terapias dirigidas contra el microambiente tumoral

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina i Ciències de la Salut

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[spa] El cáncer colorrectal (CCR) se desarrolla de manera progresiva vía distintas lesiones precancerosas partiendo desde alteraciones moleculares inicialmente invisibles para la endoscopia. Si no se detectan y tratan en fases precoces, las lesiones avanzarán hasta su diseminación metastásica corrompiendo sistemáticamente las células de su microambiente tumoral (MAT) a su favor. Una vez alcanzada esta fase de la enfermedad, el pronóstico sigue siendo nefasto hoy igual que hace 30 años. El cribado poblacional como estrategia de prevención ha demostrado ser efectivo, pero las medidas actuales todavía distan de ser perfectas. Sin embargo, aún existen importantes oportunidades para optimizar la detección precoz del CCR y sus lesiones precursoras. Asimismo, las nuevas terapias con dianas en el microambiente tumoral han generado nueva esperanza, pero aun no disponemos de herramientas adecuadas para predecir su respuesta en un paciente concreto. La presente tesis ha explorado tres nuevas vías diagnósticas para el CCR cubriendo entidades de todo el espectro de su patogenia – desde la mucosa normal, las lesiones serradas, los adenomas esporádicos y la displasia asociada a la colitis hasta la enfermedad metastásica. Estructurado por su objetivo principal, las conclusiones de los tres proyectos de la tesis son: 
Objetivo principal del primer proyecto: identificar y validar biomarcadores tipo microARN en tejido para detectar aquellos pacientes con riesgo de progresión neoplásica en la colitis ulcerosa (CU). 
1. La expresión de microARNs es diferente entre la displasia y el CCR asociado a la colitis. Algunos microARNs muestran un aumento gradual durante la progresión neoplásica en la colitis ulcerosa. 
2. Los CCR esporádicos y asociados a CU tienen patrones de expresión de microARNs distintos y algunos de los microARNs son específicos para el CCR asociado a la CU. 
3. MiR-31, -106a y -135b han sido validados en una cohorte independiente como posibles biomarcadores en mucosa para la progresión neoplásica en la CU. 
4. La investigación futura debe centrarse en desarrollar y evaluar paneles de microARNs no invasivos hasta que sean lo suficientemente sólidos como herramientas de diagnóstico antes de entrar en una validación adicional a gran escala en entornos clínicos. 
Objetivo principal del segundo proyecto: describir el fenómeno de hipermetilación del ADN en mucosa normal de pacientes con síndrome de poliposis serrada (SPS), identificar potenciales biomarcadores para esta entidad y analizar su asociación con el desarrollo de CCR. 
1. El análisis panepigenómico de metilación del ADN (mediante el kit 850K InfiniumEpic BeadChip) es capaz de identificar numerosos dinucleótidos CGs y regiones de CGs diferencialmente metilados (DMC y DMR, respectivamente) en muestras frescas congeladas de mucosa normal de pacientes con SPS. Este resultado refuerza la noción de que existe un defecto de campo en el SPS observado en estudios previos. 
2. Se han validado dos genes con DMCs en muestras parafinadas de una cohorte independiente de pacientes con SPS: HLA-F y KLF11. 
3. Siete genes mostraron cambios significativos en sus niveles de expresión, y estos se correlacionaron bien con el estado de metilación de sus CGs correspondientes. 
4. Algunos DMCs validados también están presentes en tejido de pólipo serrado junto con cambios epigenéticos adicionales: HLA-F, CDC42SE2, RBMS1, MUC21, PRR12, ANK3, SNX29, TRERF1, KLF12 y AGPAT4. 
5. Hay un enriquecimiento en los cambios de metilación en genes implicados en las vías de señalización del cáncer y la respuesta inmunitaria, pero es necesario dilucidar su posible papel en la carcinogénesis colorrectal. 
Objetivos principales del tercer proyecto: primero, investigar la capacidad de los organoides de segunda generación cultivados con interfaz aire-líquido (ALIO) para recapitular in vitro la heterogeneidad intratumoral y los componentes del MAT de las metástasis hepáticas en un modelo experimental de CCR metastásico; segundo, investigar la capacidad de los ALIOs para recapitular la respuesta a los tratamientos dirigidos contra componentes del MAT (TGF-β y PD-L1); tercero, comparar cualitativamente la capacidad predictiva de los ALIOs con un sistema de cultivo con interfaz aire-líquido alternativo: los cultivos organotípicos (COT). 
1. Los resultados del tercer proyecto confirman que es posible cultivar fragmentos de tumor durante al menos una semana manteniendo al mismo tiempo diferentes células del MAT, incluidos fibroblastos, linfocitos y células mieloides. 
2. Los ALIOs son capaces de reflejar la heterogeneidad que se observa entre las distintas metástasis originales de un mismo individuo. 
3. Se ha confirmado la factibilidad de inducir y observar respuestas a los inhibidores de los puntos de control inmunitario en los ALIOs y COTs in vitro. 
4. El hecho de que se observó una respuesta al anti-PD-1 y al anti-PD-L1 a pesar de tratarse de organoides de unos tumores poco inmunogénicos ha sido un resultado totalmente inesperado y no refleja aquella respuesta observada en los experimentos in vivo con estos tratamientos, por lo que su utilidad en este momento es al menos cuestionable. Sin embargo, era evidente que la respuesta era real debido a su reproducibilidad en múltiples experimentos, a la respuesta dosis-efecto y a la ausencia de respuesta en organoides de ratones atímicos. 
5. Las importantes limitaciones de los ALIOs son: (1) La técnica es laboriosa y todavía requiere una estandarización antes de ser aplicada a la clínica. (2) Los ALIOs reflejan la heterogeneidad intratumoral, pero esto también puede inducir resultados no consistentes. (3) La viabilidad de los ALIOs sigue siendo un desafío ya que entran rápidamente en apoptosis y necrosis en su centro y esto puede falsificar las respuestas a los tratamientos. (4) Fue dificultoso obtener muestras de calidad para otros análisis (como la citometría de flujo y la expresión génica). 
6. Los COTs, aunque menos laboriosos y con mejor preservación de la arquitectura tisular, tampoco han conseguido recapitular correctamente las respuestas a los tratamientos. 
7. Sabiendo sus puntos débiles se pueden seguir desarrollando ambos sistemas de cultivo. La creación de ALIOs vascularizados o su combinación con tecnologías microfluídicas para mejorar su perfusión y viabilidad, y el co-cultivo con células de sangre periférica (y ganglios linfáticos), serán dos puntos claves para superar sus debilidades y acercarlos más a la realidad biológica.

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Tesis Doctorals - Facultat - Medicina i Ciències de la Salut

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Descripción de biomarcadores diagnósticos en formas de alto riesgo de cáncer colorrectal y desarrollo de un modelo in vitro para la evaluación de la respuesta a terapias dirigidas contra el microambiente tumoral