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Diseño de nuevas formulaciones farmacéuticas mucoadhesivas para la quimioterapia del cáncer de colon

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biomedicina Molecular

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[spa]  El cáncer de colon representa entre el 10-12% de las enfermedades neoplásicas y es una de las causas principales de muerte por cáncer en los países occidentales. Fármacos como el irinotecan, inhibidor de la topoisomerasa I, o el oxaliplatino, compuesto de platino de tercera generación, han mejorado los resultados obtenidos con 5-fluorouracilo. La agresividad de los nuevos citostáticos impone consideraciones adicionales sobre las formulaciones o las vías de administración más apropiadas para cada tratamiento. El objetivo es reducir su toxicidad y los efectos secundarios no deseados. Así, la vehiculización controlada adquiere un protagonismo especial, ya que permite dirigir el fármaco a una diana específica y ralentizar su liberación para que su efecto se prolongue en el tiempo.
El trabajo experimental de esta Tesis se ha centrado en el diseño y desarrollo de dos formulaciones liposomales estables para las camptotecinas CPT-11 y SN-38. Su potencial aplicabilidad se ha determinado sobre la base de una rigurosa caracterización fisicoquímica de las vesículas obtenidas; de estudios de estabilidad de los sistemas lípido-fármaco basados en el análisis biofísico de las interacciones entre los componentes de la formulación y en la determinación del comportamiento físico de las suspensiones liposomales a lo largo del tiempo; y en la evaluación de la actividad citotóxica y del mecanismo de la muerte celular inducida por los fármacos vehiculizados mediante estudios in vitro con modelos celulares apropiados.     Además, se han preparado vesículas mucoadhesivas creando un recubrimiento sobre la superficie liposomal con el polisacárido catiónico quitosano.
El análisis de un número significativo de mezclas lipídicas, junto con la consideración del método de preparación, han permitido establecer los protocolos definitivos para formular el CPT-11 y el SN-38 en liposomas. El CPT-11 se ha encapsulado eficazmente en liposomas termosensibles mediante un procedimiento sencillo y reproducible. La interacción electrostática entre el fármaco y uno de los lípidos que forman la bicapa, situado preferentemente en su monocapa interna, garantiza que el producto se mantenga encapsulado a pesar de que sus propiedades de solubilidad determinan la localización en el espacio acuoso del liposoma. En cuanto al SN-38, se ha seguido una estrategia de formulación diferente debido a la gran insolubilidad del compuesto. La composición lipídica y el método de preparación son innovadores y permiten incorporar un 95-100% del fármaco. Ambas formulaciones (CPT-11lip y SN-38lip) se han obtenido en forma de liofilizados estables y de fácil reconstitución que mantienen inalteradas las propiedades iniciales.
La formulación CPT-11lip se internaliza mediante un proceso de endocitosis y se acumula en los lisosomas. Desde allí, el fármaco es capaz de alcanzar el núcleo y ejercer un efecto genotóxico que es reparado en la línea celular sana Hs68 pero no en la tumoral HeLa. También se demuestra que CPT-11lip no es citotóxico para fibroblastos Hs68, pero induce una apoptosis masiva en células HeLa. En el caso de la formulación SN-38lip, el estudio se ha realizado con células HeLa y Caco2 y la respuesta al tratamiento es diferente: en HeLa se induce un proceso de apoptosis y en Caco2 se observa una parada de ciclo en la fase S que puede conducir a supresión de la proliferación celular. Además, las formulaciones CPT-11lip y SN-38lip son internalizadas mejor que los fármacos solubilizados en otros excipientes por los tipos celulares ensayados y que, por consiguiente, presentan una toxicidad mayor.
La interacción electrostática del quitosano con la superficie negativa de las bicapas de las formulaciones estudiadas establece la base para la formación de una cubierta polisacárida estable alrededor de los liposomas. Se han determinado las condiciones y el protocolo para la obtención de liposomas recubiertos de quitosano y se ha confirmado que la capa del polímero sobre la superficie liposomal es la responsable de la mucoadhesión.

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[eng]  In cancer treatment, the aggressiveness of new cytostatics imposes additional considerations about which are the most appropriate formulations or the administration routes for each drug. The aim is to reduce their toxicity and undesirable side effects. Thus, controlled delivery plays a central role, since it allows to direct the drug to a specific target and to delay its release so that the therapeutic effect can be sustained over time.
This thesis has been focused on the design and development of two stable liposomal formulations for CPT-11 and SN-38, two camptothecins. Its potential applicability has been determined on the basis of a rigorous physicochemical characterization of the vesicles; the stability studies of the lipid-drug systems; and in the in vitro evaluation of the cytotoxic activity and the assessment of the mechanism of drug-induced cell death. Mucoadhesive vesicles have also been prepared by creating a coating on the liposomal surface with the cationic polysaccharide chitosan.
The analysis of several lipid mixtures, together with the consideration of the preparation method, allowed establishing the final protocols for formulating CPT-11 and SN-38 in liposomes. Both drugs were efficiently entrapped at high percentages in the vesicles and the formulations (CPT-11lip and SN-38lip) have been obtained in the form of stable and easily reconstituted lyophilizates.
CPT-11lip and SN-38lip formulations were internalized better than the drugs solubilized in other excipients by all the cell types tested and therefore have a higher toxicity. The CPT-11lip formulation was internalized by a process of endocytosis and accumulates in the lysosomes. It is also shown to be non-cytotoxic for Hs68 fibroblasts, but induces massive apoptosis in tumoral cells. In the case of the SN-38lip formulation, the study was performed with HeLa and Caco2 cells with a different response to the treatment: an apoptosis process was induced in HeLa whereas in Caco2 there was a cell cycle arrest in S phase that may lead to suppression of cell proliferation. 
The electrostatic interaction of chitosan with the negative surface of the liposome bilayers establishes the basis for the formation of a stable polysaccharide coating around the vesicles. The conditions and protocol for obtaining chitosan-coated liposomes have been assessed and it has been confirmed that the polymer layer on the liposomal surface is responsible for mucoadhesion.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biomedicina Molecular

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Diseño de nuevas formulaciones farmacéuticas mucoadhesivas para la quimioterapia del cáncer de colon