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Actividad citocromo P450 aromatasa en la lubina ("Dicentrarchus Labrax" L.)

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Universitat de Barcelona. Departament de Fisiologia (Biologia)

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La finalidad de este estudio fue entender la función de la actividad aromatasa (AA) en el eje cerebro-gónada de los peces, empleando la lubina (Dicentrachus labrax L.) como modelo. Se utilizó el ensayo del agua tritiada para medir la AA utilizando 1ß-3H-androstenediona como sustrato. Este método fue optimizado para temperatura y tiempo de incubación, fuerza iónica y pH del tampón, cantidad de sustrato, tejido y cofactores. Se usaron diferentes tipos de controles, incluyendo muestras sin sustrato o cofactor, con exceso de producto, desnaturalizadas, así como inhibidores específicos de la aromatasa (Fadrozole y 4-hidroxiandrostenediona; 4-OH-delta-[4]), y también agua tritiada auténtica para calcular recuperaciones. Las incubaciones se llevaron a cabo con 10 mg de tejido fresco en un volumen final de 0.4 ml. Las condiciones óptimas para medir la AA fueron: tampón fosfato a 50 mM, pH 7.4 y temperatura de incubación de 30°C. Al emplear homogenados, se requirió la presencia de cofactores en las incubaciones. Por ello, se incorporó un sistema generador de NADPH, con una concentración de NADP de 1 mM. La concentración de sustrato fue normalmente 150 nM, después de determinar que concentraciones de 100 nM y superiores eran saturantes. Para completar la validación el método del agua tritiada se utilizó el método directo de medida de estrona, con 7-[3]H-androstenediona como sustrato. Los metabolitos formados se identificaron por cromatografía de capa fina (TLC). Con incubaciones hasta 30 min ambos métodos dieron idénticos resultados. Por ello, 30 min fue el tiempo de incubación en las subsiguientes determinaciones. Se usó el método descrito para determinar si existía AA diferentes en cerebro vs ovario. Se encontró que la aromatasa en homogenados de cerebro de lubina posee una K[sub m] de 7,3 ± 0,6 nM y una V[sub max] de 7,9 ± 0,1 pmol/mg proteína/h, mientras que la del ovario posee una K[sub m]de 4,6 ± 1,3 nM y una V[sub max] de 2,1 ± 0,6 pmol/mg proteína/h. También se estudió la distribución de la mencionada actividad en diferentes órganos y encontró que la mayoría de la AA por unidad de proteína se localizaba en el cerebro, como era de esperar, seguida del ovario, la grasa visceral, el hígado y el riñón anterior, mientras que era despreciable en el resto de tejidos analizados, incluyendo los testículos. En el cerebro, la AA estaba concentrada en la parte anterior (hipotálamo, bulbo olfatorio y telencéfalo), así como en la hipófisis, pero se detectó muy poca AA en el bulbo óptico, cerebelo y médula. Para investigar la relación entre la aromatasa y el ciclo reproductor, la AA se analizó durante un año entero y se correlacionó con la actividad gonadal, indicada por los cambios en el índice gonadosomático (GSI) por los niveles circulantes de esteroides sexuales (testosterona y estradiol). Los resultados mostraron que la máxima AA del cerebro coincidía con la época de puesta, precedida por niveles máximos de testosterona, observados dos meses antes. En lubinas juveniles que estaban completando la diferenciación sexual, la AA en el cerebro era ya detectable, aunque a niveles significativamente menores que los observados en adultos. Por ello, se decidió medir la AA a lo largo del primer año de vida encontrando un máximo a 200 DPH y otro a 300 DPH en el cerebro de ambos sexos, sin embargo en gónadas el máximo se observó a 250 DPH en ambos sexos con mayores valores en hembras que en machos y una brusca caída en machos a 300 DPH. Esto sugiere un requerimiento de estrógenos para el desarrollo de las gónadas independientemente del sexo fenotípico final seguido de una síntesis continuada de estrógeno durante más tiempo para el desarrollo específico del ovario. El método directo de medida de estrona mostró que la mayoría de la androstenediona (38%) permanecía sin transformar y que los principales metabolitos identificados (testosterona>>estradiol>estrona), juntos sumaban un 40% de la actividad inicial. Aprovechando que esta actividad es excepcionalmente alta en el cerebro de la lubina, igual que sucede en otros peces se planteó entonces la hipótesis de que la actividad de la 11ß-hidroxilasa podía estar transformando el 22% de sustrato restante en 11-ß-hidroxiandrostenediona. Experimentos diseñados para tal fin mostraron que la 11ß-hidroxiandrostenediona (11ß-OH-delta [4]), y no la estrechamente relacionada 11ß-hidroxitestosterona (11ß-OHT), actuaba como un inhibidor de la AA de forma dosis-dependiente, reversible, competitiva, y total con una IC[sub 50] (30 microM) sólo de uno y dos ordenes de magnitud más que los de los potentes inhibidores de la aromatasa 4-OH y Fadrozole, respectivamente. Se demuestra por primera vez en vertebrados inferiores o anamniotas que un neuroandrógeno, el 11ß-OH-delta [4], actúa como regulador de la síntesis de neuroestrógeno.

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Tesis Doctorals - Departament - Fisiologia (Biologia)

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Actividad citocromo P450 aromatasa en la lubina ("Dicentrarchus Labrax" L.)