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Evaluación de la actividad anti-inflamatoria mediante modelos experimentales basados en el embrión de pez cebra. Aplicación a compuestos presentes en la Alimentación

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Universitat de Barcelona. Departament de Farmacologia i Química Terapèutica

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[spa]  Durante las últimas dos décadas se han realizado estudios que sugieren que la inflamación crónica, asociada a una situación de continuo estrés oxidativo, puede ser un factor etiológico en muy diversas patologías como el cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, neurológicas y pulmonares. El pez cebra es un modelo ampliamente utilizado en diversos ámbitos de la biología experimental, incluyendo el estudio de mecanismos de patologías humanas y los mecanismos de las repuestas inmunitarias. El pez cebra presenta similitudes genéticas con humanos de un 70 a 80%. Al mismo tiempo, las respuestas oxidativas e inflamatorias pueden ser fácilmente inducibles, reproducibles y visualizadas en sus primeras etapas de desarrollo. Los ensayos realizados mediante embriones o larvas son ensayos in vivo, pero con muchas de las ventajas de los métodos in vitro. El principal objetivo de este proyecto ha sido evaluar la capacidad de modelos experimentales basados en el pez cebra para el screening de substancias naturales presentes en la dieta con actividad anti-inflamatoria y anti-oxidante.
Concretamente, en este estudio, se han optimizado y aplicado dos modelos experimentales mediante embriones y larvas de pez cebra. En el primero se evalúa la actividad inhibitoria sobre la migración de neutrófilos en larvas. En el segundo se observa el efecto protector sobre el estrés oxidativo inducido por exposición a un agente oxidante en embriones. Se ha evaluado varios carotenoides, incluyendo el beta-caroteno, licopeno y astaxantina, compuestos fenólicos como naringenina, cianidina, curcumina, entre otros, así como un extracto de sofrito de tomate, uno de los principales ingredientes de la dieta mediterránea.
En el primer modelo, hemos optimizado los parámetros experimentales, usando larvas de pez cebra de 4 días post fertilización despigmentadas. Nuestros resultados mostraron que la mayoría de compuestos utilizados, incluido el sofrito de tomate disminuyen la migración de neutrófilos significativamente respecto del control. Los compuestos que presentaron mayor disminución de la migración fueron: ácido clorogénico (66.7%), cianidina (62.5%) respectivamente, mientras que los fármacos anti-inflamatorios (indometacina,  piroxicam)  y  compuestos  inhibidores  de  enzimas  NADPH  oxidasas
 
(dibenzoidolium, apocinina) presentan porcentajes de reducción de la migración superiores al 70%. Por el contrario, no se observó ningún efecto al utilizar la amantadina conocido fármaco no anti-inflamatorio. Y en el caso del extracto de sofrito de tomate se reporta una disminución del 40% en la migración.
El segundo modelo fue previamente desarrollado en nuestro laboratorio por Boix, (2015). Hemos determinado el efecto protector sobre el estrés oxidativo con los mismos compuestos, en embriones de pez cebra de 0 – 48 horas post fertilización. Hemos observado que la mayoría de compuestos probados, presentan un efecto protector en la letalidad, provocada por el inductor del estrés oxidativo tert-butil hidroperóxido (tBOOH). Además, se observó un efecto protector frente a las anormalidades morfológicas en los de casos de rutina, apigenina y curcumina.
Cabe mencionar que se realizaron estudios complementarios de permeabilidad de carotenoides en larvas de pez cebra mediante HPLC-DAD UV, así como análisis de expresión génica de citoquinas pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6 y TNF-α) por real-time PCR. En el primer caso se comprobó que existe permeabilidad de carotenoides en larvas de pez cebra. Mientras que en el segundo caso no se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados y los controles.

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[eng]  During the last two  decades,  studies  have  been  carried  out  suggesting  that chronic inflammation, associated with a situation of continuous oxidative stress, can be an etiologic a l  factor in many different pathologies such as cancer, diabetes, cardiovascular, neurological and pulmonary  diseases.
The zebrafish is a model  widely  used  in  various  fields  of experimental  biology,  including  the study of mechanisms of human pathologies and  mechanisms  of  immune responses.  The zebrafish presents genetic similarities  with  humans of 70 to 80%. At the  same  time,  oxidative  and inflammatory responses can be easily inducible, reproducible and visualized in  their  early stages of development. Furthermore, the  in  vivo  zebrafish embryos and  larvae  assays  have many  of the advantages   presented  in  vitro methods.
The principal  aim  of this  work was to evaluate  the anti-inflammatory  and anti-oxidant  activity  of natural substances present in the diet, with experimental models based on these substances´ screening on zebrafish. In this study, two experimental models were optimized and applied in zebrafish  embryos  and larvae.
In the first model, the inhibitory effect on neutrophil migration in larvae was evaluated. In the  second model, the protective effect on oxidative  stress  induced  by exposure  to  an oxidizing  agent  was observed.
Several carotenoids have been evaluated, including beta-carotene, lycopene and astaxanthin, phenolic compounds such as naringenin, cyanidin, curcumin,  among  others,  as well  as tomato sauce  extract,  one of the main  ingredients   of the Mediterranean   diet.
During the first model  application, were  used  a 4 days’ post-fertilization  zebrafish  larvae  and were optimized the experimental parameters. Results showed that most of the compounds used, including tomato sauce (sofrito), significantly reduce neutrophil migration compared to control group.
The compounds that showed the greatest decrease on migration were: chlorogenic acid (66.7%), cyanidin (62.5%) respectively, while anti-inflammatory drugs (indomethacin, piroxicam) and NADPH oxidase inhibitor compounds (dibenzoidolium,  apocynin)  reduced  neutrophil  migration  over 70%.
 
In contrast, no effect was observed when using the known non-anti-inflammatory  drug amantadine.  And in  the case of the  tomato  sauce  extract,  it  reduced  40% neutrophil migration.


The second model was previously developed in same laboratory by Boix, (2015). Have been determined the protective effect on oxidative stress with the same compounds in 0-48 hours- post-fertilization  zebrafish  embryos.
It had been observed most compounds  tested  have  a protective  effect  on the  lethality,  caused by the oxidative stress  inducer  tert-butyl  hydroperoxide  (tBOOH).  In  addition,  a protective effect against morphological abnormalities was observed in cases of routine,  apigenin  and curcumin.
It had been performed complementary studies  of carotenoid  permeability  in  zebrafish larvae using HPLC DAD UV, as well as gene expression analysis  of pro-inflammatory  cytokines  (IL- 1β, IL-6 and TNF-α) by real-time   PCR.
In the first  case it  was verified  that  there  is  permeability  of carotenoids  in  zebrafish  larvae.  In the second case, no significant differences were observed between the treated groups and the controls.

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Tesis Doctorals - Departament - Farmacologia i Química Terapèutica

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Evaluación de la actividad anti-inflamatoria mediante modelos experimentales basados en el embrión de pez cebra. Aplicación a compuestos presentes en la Alimentación