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Analisis de la expresión y la función del gen beta-amyloid protein precursor like en relación a la vía de RasI en el disco imaginal de ojo de Drosophila melanogaster

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Universitat de Barcelona. Departament de Genètica

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[spa] Drosophila es un modelo versátil para entender las bases genéticas de la señalización celular. En particular, el ojo compuesto de Drosophila proporciona un tejido ideal para estudiar los mecanismos de integración de señales que dirigen la formación de la red de neuronas fotorreceptoras. La vía de Ras/MAPK está involucrada en la determinación de todos los fotorreceptores, pero es particularmente necesaria para la especificación del fotorreceptor R7, ya que su ausencia determina la transformación  del R7 en una célula no neural. De manera que durante el desarrollo del ojo, Ras media la decisión entre la diferenciación neural y no neural. Sin embargo, se desconoce el perfil de genes activados por Ras. Con el objetivo de describir este perfil, hemos realizado microarrays comparando diferentes alelos del receptor tirosina quinasa Sevenless (Sev) que participa en la especificación del R7 mediante la activación de la vía de  Ras / MAPK.  Uno de los genes que responden a la activación de Sev es el gen amyloid protein precursor-like (Appl). El incremento de la expresión de Appl detectado en los microarrays, también se confirmó por hibridación in situ.

En un estudio detallado de localización de la proteína, observamos que aunque está presente en todos los fotorreceptores, hay más proteína Appl en R7 y R8, que en los otros. Para evaluar si Ras es necesario para la activación de Appl, realizamos clones con el alelo dominante negativo del gen Epithermal Growth factor Receptor (DERDN). En estos clones no se detectó Appl, mientras que los clones del alelo constitutivamente activo de Ras; RasV12 dieron lugar a la sobreexpresión de Appl. En cualquier otro tejido, RasV12 no produjo expresión ectópica, indicando que Ras es necesario y suficiente para la expresión de Appl aunque esta regulación es dependiente del dominio del ojo. Para ver si el factor de transcripción de la vía; Pnt, es capaz de unirse a Appl para activar su expresión realizamos clones con el alelo de pérdida de función pntΔ88. Estos clones mostraron que la falta de pnt tiene como resultado la ausencia de Appl. En segundo lugar evaluamos la posible unión directa de Pnt a Appl mediante  transgénicos de regiones supuestamente enhancers de Appl unido a un promotor mínimo y al gen reportero lacZ. Ninguna de las construcciones fue capaz de dirigir la expresión de lacZ en ojo, sin embargo dos de ellas fueron capaces de dirigirla en cerebro, sugiriendo que estas dos secuencias actúan como unidades reguladoras de la expresión de Appl. Ya que no produjeron expresión en ojo, decidimos sensibilizar la respuesta de las construcciones a Ras, incrementando la actividad de la vía mediante clones RasV12. En este nuevo contexto, los dos ETS que tenían expresión en cerebro, fueron capaces de dirigir la expresión de lacZ. Además la unión de pnt a Appl se confirmó mediante experimentos de InmunoPrecipitación de la Cromatina (CHIP).

Ras en ojo es responsable de la determinación de casi todos los fotorreceptores, sin embargo observamos que mientras que la determinación no está afectada en mutantes Appld, sí lo está el funcionamiento del R7. Este fotorreceptor es el único capaz de ver la luz ultravioleta. Mediante experimentos de comportamiento observamos que las moscas Appld tienen disminuida la capacidad de discernir la luz UV. Esta reducción es debida en parte porque el 2% de los axones de R7 de moscas Appld no llegan a hacer la sinapsis. Para tratar de incrementar los efectos observados y poder describir con mayor claridad la función de Appl en ojo, testamos la habilidad de los mutantes Appld de discernir el UV, en combinación con mutantes heterocigotos de proteínas descritas en el proceso de guía de axones. La perdida de función de Appl combinada con el mutante heterocigoto del gen neurotactina (nrt), produjo un claro deterioro de la capacidad del R7 para discernir UV y de los axones pare llegar a hacer la sinapsis demostrando que Appl es necesario para la correcta función del R7.

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[eng] In a genome wide expression profile search for genes that characterize the Drosophila R7 photoreceptor specification we found Appl, the ortholog of human APP and a key factor in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. We analyzed Appl expression in the eye imaginal disc and found that is highly accumulated in R7 photoreceptor cells. The R7 photoreceptor is responsible for UV light detection. To explore the link between high expression of Appl and R7 function, we have analyzed Appl null mutants and found reduced preference for UV light, likely due to mistargeted R7 axons. Moreover, axon mistargeting and inappropriate light discrimination are enhanced in combination with neurotactin mutants. R7 differentiation is triggered by the inductive interaction between R8 and R7 precursors, which results in a burst of Ras1/MAPK activated by the tyrosine kinase receptor Sevenless. Thus, we have studied whether Ras1/MAPK is responsible for the high Appl expression. Inhibition of Ras1 signaling leads to reduced Appl expression, whereas constitutive activation drives ectopic Appl expression. We show that Appl is directly regulated by the Ras/MAPK pathway through a mechanism mediated by PntP2, an ETS transcription factor that specifically binds ETS sites in the Appl regulatory region. Also, the zebrafish appb expression increased after ectopic fgfr activation in the neural tube of zebrafish embryos, suggesting a conserved regulatory mechanism.

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Tesis Doctorals - Departament - Genètica

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Analisis de la expresión y la función del gen beta-amyloid protein precursor like en relación a la vía de RasI en el disco imaginal de ojo de Drosophila melanogaster