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Effects of ageing and genetic risk variants at 4q25 on the calcium homeostasis in cardiac myocytes

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina

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[eng] Background Ageing is a risk factor that promotes common cardiovascular diseases such as atrial fibrillation (AF) or heart failure (HF), which in turn are associated with pathological changes in intracellular calcium homeostasis. However, the effects that ageing could have on the calcium homeostasis in human atrial cardiomyocytes are not well known. Furthermore, genetic risk variants at single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with a higher incidence of AF have been identified in the chromosomal region 4q25, close to the locus of the Pitx2 transcription factor that plays an important role in cardiac embryonic development. In the adult heart AF has been associated with changes in the expression of Pitx2, but findings are contradictory and the relationship between the 4q25 risk variants and Pitx2 function remain controversial. Moreover, no functional effects of the 4q25 risk variants on the calcium homeostasis have been identified so far. Therefore, in this thesis we investigated how the two risk factors, ageing and risk variants at 4q25, affect the intracellular calcium homeostasis with the intention of identifying mechanisms that underlie potentially arrhythmogenic changes in the calcium homeostasis caused by these risk factors. Hypothesis Ageing and 4q25 risk variants produce alterations in the intracellular calcium homeostasis in atrial myocytes that alone or in combination contribute to increase the propensity to atrial fibrillation. Aims of the thesis * Analyze the effects of ageing on the mechanisms that regulate the calcium homeostasis in human atrial myocytes. * Use transgenic murine models of ageing to identify molecular mechanisms underlying ageing-dependent changes in the calcium homeostasis. * Investigate how risk variants on chromosome 4q25 associated with increased AF risk, affect electrophysiological characteristics of human atrial myocytes and to identify underlying molecular mechanisms. * Investigate how ageing modulates the effects of 4q25 risk variants in human atrial myocytes. Methods Experiments were performed on isolated atrial or ventricular cells from human or murine models. Electrophysiological data were obtained using patch- clamp techniques and confocal microscopy. RT-PCR and western blot techniques were used to determine the expression levels of mRNA and the proteins studied. Results The results described in this thesis show that aging decreases the amplitude of the calcium current (ICa), an electrophysiological parameter that is also reduced by AF, the calcium content of the sarcoplasmic reticulum (SR), and the global calcium transient. These findings are corroborated by comparable changes in the expression of the proteins undertaking the corresponding calcium transport or buffering. Together, these changes likely reduce atrial contraction in the elderly. The results were reproduced in an animal model of premature aging (Zmpste24-/-) with defective lamin processing, reinforcing the notion that this mechanism may, at least partially, underlie the observed effects of aging on the calcium homeostasis in human atrial myocytes. In addition, ageing accentuated some of the effects of ageing on calcium handling in patients with a previous history of AF. Of particular interest, the ICa amplitude was further depressed by aging in patients with AF, which might contribute to maintain atrial arrhythmic episodes in these patients. The study of risk variants on chromosome 4q25 shows that the presence of the rs13143308T risk variant, alone or together with the risk variant rs2200733T, was associated with a higher frequency of spontaneous calcium release, transient inward currents (ITI) and membrane depolarizations, typical of AF. These results are the first to provide an electrophysiological mechanism that could explain a higher incidence of AF in individuals carrying risk variants at 4q25. Moreover, electrophysiological studies in right atrial myocytes from a mouse model with atrial Pitx2 insufficiency (NppaCre+Pitx2fl/-) reproduces all alterations in calcium homeostasis observed in patients with 4q25 risk variants. These results support the notion that modulation of the intracellular calcium handling by Pitx2 plays an important role in electrophysiological processes associated with AF. Analysis of potential synergies between risk variants at 4q25, ageing, and AF revealed that several effects of ageing were accentuated in patients with AF whereas aging per se does not modify the effects of the 4q25 risk variants on calcium homeostasis. However, as aging reduces the amplitude of ICa, which would reduce the atrial refractory period, this could prolong the duration of atrial arrhythmic episodes favored by the higher frequency and amplitude of spontaneous membrane depolarizations in carriers of 4q25 risk variants. Conclusions Ageing modulates calcium homeostasis in human atrial myocytes by decreasing ICa, calcium transient and SR calcium load. These changes are reproduced in a progeric mouse model, favoring a progressive decline of contractile function with age. Moreover, the observed ICa reduction is a characteristic feature of AF that may favor its maintenance in elder patients. Risk variants located on the chromosomal region 4q25, specifically the variant rs13143308T, alone or together with rs2200733T, increases spontaneous calcium release, ITIs, and membrane depolarizations. These changes are reproduced in a mouse model of Pitx2 insufficiency, and are all hallmarks of AF that could favor the initiation of arrhythmic events in carriers of the risk variants. The combined effects of 4q25 risk variants and ageing may work synergistically to promote atrial arrhythmia, with the former constituting an arrhythmogenic electrophysiological substrate that favor initiation of atrial arrhythmic episodes, and with ageing favoring their maintenance.

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[spa] Antecedentes El envejecimiento es un factor de riesgo que favorece enfermedades cardiovasculares comunes como la fibrilación auricular (FA) o la insuficiencia cardíaca (IC), que a la vez se asocian a cambios patológicos en la homeostasis intracelular de calcio. Sin embargo, no se conocen los efectos que el envejecimiento puede tener sobre los mecanismos de la homeostasis del calcio en cardiomiocitos auriculares humanos. Por otro lado, se han descrito variantes de riesgo genéticas asociadas a la FA en la región cromosómica 4q25, próximas al factor de transcripción Pitx2 que tiene un papel importante en el desarrollo cardíaco embrionario. En el corazón adulto Pitx2 se ha asociado a predisposición a arritmias auriculares, pero la relación que existe entre los variantes de 4q25 y la función de Pitx2 es controvertida. Además, se desconocen los efectos que los variantes de riesgo 4q25 tienen sobre la homeostasis del calcio. Por ello, en esta tesis se han investigado los mecanismos que pueden subyacer a los dos factores de riesgo envejecimiento y variantes de riesgo en 4q25. Hipótesis El envejecimiento y las variantes de riesgo en 4q25 producen alteraciones en la homeostasis del calcio intracelular en miocitos auriculares, que por sí solas o en combinación contribuyen a aumentar la propensión a la fibrilación auricular. Objetivos * Analizar los efectos del envejecimiento en los mecanismos que regulan la homeostasis del calcio en miocitos auriculares humanos. * Utilizar modelos murinos transgénicos de envejecimiento para identificar los mecanismos moleculares que subyacen a los cambios en la homeostasis del calcio debido al envejecimiento. * Investigar cómo las variantes de riesgo en el cromosoma 4q25 asociadas con un mayor riesgo de FA, afectan a las características electrofisiológicas de los miocitos auriculares humanos e identificar los mecanismos moleculares subyacentes. * Investigar como la edad modula los efectos de las variantes de riesgo en 4q25 en miocitos auriculares humanos. Métodos Los experimentos se llevaron a cabo en células auriculares o ventriculares aisladas de humano o de los distintos modelos murinos. Mediante las técnicas de patch-clamp y microscopía confocal se obtuvieron los datos electrofisiológicos. Las técnicas de RT-PCR y western blot se usaron para determinar los niveles de las proteínas estudiadas. Resultados Los resultados de esta tesis muestran que el envejecimiento disminuye la corriente de calcio (ICa), parámetro electrofisiológico que también está reducido en la FA, así como del contenido de calcio del retículo sarcoplásmico (RS), del calcio transitorio global y de las principales proteínas reguladoras del calcio, lo que conjuntamente podría reducir la contracción auricular en los ancianos. Estos resultados fueron reproducidos en modelo animal de envejecimiento prematuro (Zmpste24-/-) que no procesan correctamente la proteína lamina, reforzando la noción que este mecanismo podría subyacer a los efectos del envejecimiento sobre la homeostasis del calcio en las miocitos cardíacos. Además se encontró que en pacientes con previa historia de FA, el envejecimiento tenía un efecto sumatorio sobre algunos efectos deteriorantes de la FA sobre el manejo de calcio, acentuando así a disminución de la ICa con la edad. El estudio de las variantes de riesgo en el cromosoma 4q25 muestra que la variante de riesgo rs13143308T por sí sola o junto con rs2200733T están asociadas a alteraciones electrofisiológicas típicas de la FA. Así, miocitos de pacientes portadores de estas variantes tenían una mayor frecuencia de liberación espontánea de calcio, corrientes de entrada transitorias (ITIs) y despolarizaciones de membrana espontaneas. Estos resultados son los primeros en proporcionar un mecanismo electrofisiológico que podría explicar la mayor incidencia de FA en individuos con variantes de riesgo en 4q25. Estudios electrofisiológicos en miocitos auriculares de un modelo de ratón con deficiencia auricular de Pitx2 (NppaCre+Pitx2fl/-) reproduce todas las alteraciones en la homeostasis del calcio observados en pacientes con variantes de riesgo 4q25. Estos resultados avalan la noción de que la modulación del calcio intracelular por Pitx2 juega un papel importante en procesos electrofisiológicos asociados a la FA. El análisis de potenciales efectos sinérgicos entre variantes de riesgo en 4q25, envejecimiento y la FA revelaba que el envejecimiento per se no modifica los efectos que tiene las variantes 4q25 sobre la homeostasis del calcio. Sin embargo, dado que el envejecimiento reduce la amplitud de la ICa, lo cual reduciría el periodo refractario auricular, podría favorecer la prolongación o el mantenimiento de episodios de arritmia inducidas por actividad eléctrica espontanea. Por lo tanto, es posible que las variantes de riesgo 4q25 constituyan un sustrato electrofisiológico arritmogénico que favorece el inicio de episodios arrítmicos auriculares, y que el envejecimiento actúe prolongando la duración de estos episodios al reducir el periodo refractario auricular a través de la reducción de la amplitud de la ICa. Conclusiones El envejecimiento modula la homeostasis del calcio en miocitos auriculares humanos mediante la disminución de la Ica, del calcio transitorio y del calcio acumulado en el RS. Estos cambios favorecen por un lado el deterioro progresivo de la función contráctil con la edad, y por otro el acortamiento del período refractario mediado por la reducción de la amplitud de la ICa. El modelo murino Zmpste24-/- reproduce los efectos observados reforzando el mecanismo propuesto. Las variantes de riesgo localizadas en la región cromosómica 4q25, concretamente rs13143308 por sí sola o junto con rs2200733, aumentan la liberación espontánea de calcio, ITI y despolarizaciones de la membrana, parámetros característicos de la FA, pudiendo originar eventos arrítmicos en pacientes portadores de las variantes de riesgo. El modelo murino con deficiencia parcial de Pitx2 (NppaCre+Pitx2fl/-) reproduce lo observado en humanos portadores de las variantes de riesgo, reforzando la idea de Pitx2 como nexo entre las variantes de riesgo 4q25 y las alteraciones que provocan en la homeostasis del calcio. La combinación de los efectos encontrados en este estudio propondría a las variantes de riesgo en 4q25 como un substrato arritmogénico que favorece la iniciación de episodios arrítmicos y al envejecimiento como factor que los prolongaría debido a la reducción del período refractario producido por la reducción de la amplitud de la ICa.

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Effects of ageing and genetic risk variants at 4q25 on the calcium homeostasis in cardiac myocytes