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Islet amylold in type 2 diabetes: The role of chaperones in endoplasmic reticulum stress and amyloid formation in pancreatic β-cell

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Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina

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[spa] La disminución de la masa de célula ß pancreática y la función en la diabetes tipo 2 (T2D) se puede atribuir a una serie de factores estresantes experimentados por el islote durante el desarrollo y la progresión de la enfermedad, incluyendo el amiloide de los islotes. El amiloide de los islotes pancreáticos se compone predominantemente del péptido humano amilina, también conocido como polipeptido amiloide del islote humano (hIAPP). Estos depósitos están implicados en el proceso de deterioro de las células ß y en la reducción de la masa celular ß e implica la agregación de monómeros solubles normales del péptido de la célula ß en oligomeros, fibrillas y, en última instancia, en depósitos de amiloide maduros. El mecanismo que subyace a la formación y agregación de hIAPP no está del todo claro. Sin embargo, varios estudios demostraron que el aumento de la síntesis de hIAPP dentro de la célula ß pancreática y su cambio conformacional a la lámina de estructura ß podría ser factores importantes para los depósitos de amiloide. El estrés del Retículo Endoplasmático (RE) ha sido implicado en la T2D relacionada con la obesidad, contribuyendo tanto a la resistencia a la insulina y como a la disfunción de las células ß del páncreas. La acumulación de proteínas mal plegadas puede perturbar el plegamiento de las proteínas en el RE y conducir a una alteración en la homeostasis del RE. Como consecuencia, la respuesta al estrés de RE se activa con el fin de restablecer el equilibrio entre la capacidad de plegamiento de proteínas y la carga de proteínas. En consecuencia, las cascadas sucesivas de transducción de señales se activan y se denominan colectivamente como la respuesta de la proteína desplegada (unfolding protein response, UPR). Este mecanismo incluye la atenuación de traslación de síntesis de proteínas, la degradación de proteínas asociadas al RE y la inducción de las chaperonas moleculares, un grupo de proteínas esenciales que ayudan al plegamiento de las proteínas recién sintetizadas, incluyendo la insulina y IAPP en la célula ß pancreática. También se sabe que muchas enfermedades neurodegenerativas están asociadas con la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE que conducen al estrés de RE y a la pérdida progresiva de células. Dado que esta es una característica común observada también en T2D, la acumulación de agregados de la proteína IAPP puede ser responsable por la inducción o progresión del estrés de RE y en última instancia, el responsable por la inflamación de los islotes y su muerte. La célula ß pancreática se enfrenta al reto de aumentar la síntesis de proteínas durante una estimulación aguda o crónica. Esto provoca una carga en el RE, el orgánulo donde la síntesis y plegamiento de insulina y IAPP tienen lugar. Los factores plegables denominados chaperonas se unen a las proteínas secretoras desplegadas y las ayudan al plegamiento y agregación. Cada vez más pruebas sugieren que las chaperonas juegan un efecto protector importante en la disminución de la agregación de proteínas y en la fisiopatología de la deposición de amiloide. Además, la sobreexpresión de algunas chaperonas del RE puede proteger la célula contra la muerte celular causada por alteraciones de la homeostasis del RE. De interés, los ratones transgénicos que sobreexpresan la chaperona molecular BiP en células ß están protegidos contra la patogénesis de la T2D inducida por la obesidad, manteniendo la función de la célula ß y mejorando la homeostasis de la glucosa. Con la sobreexpresión de BiP también se ha demostrado que atenúa el estrés de RE inducido por ácidos grasos, asi como, la apoptosis en los hepatocitos. Además, BiP es una de las chaperonas responsables para el tráfico del IAPP a través del RE y aparato de Golgi en la célula ß pancreática humana. Del mismo modo, se ha verificado que la menor disponibilidad de la chaperona endógena, proteína disulfuro isomerasa (PDI), contribuye a los efectos tóxicos de la agregación de proteínas en la deficiencia de a1-antitripsina, lo que sugiere que ambos, BiP y PDI pueden tener potencial interés en el plegamiento y agregación de IAPP. Además, los últimos informes indican los efectos beneficiosos de determinados compuestos químicos (chaperonas farmacológicas) en el estrés de RE y en aliviar y mejorar el plegamiento de proteínas.El 4-Fenil butírico (PBA) y la taurina conjugado de ácido ursodesoxicólico (TUDCA) fueron capaces de aliviar el estrés de RE en células y animales. Aunque el papel del hIAPP en el desarrollo de la diabetes no está bien establecido, se ha sugerido que IAPP contribuye al aumento del estrés de la célula ß. Nuestro grupo ha demostrado que la agregación extracelular de hIAPP deteriora la vía ubiquitina-proteasoma y que además está implicada en el estrés de RE mediada por apoptosis de la célula ß pancreática. Las células INS1E, una línea de células ß de páncreas de rata, que expresan establemente hIAPP (hIAPP-INS1E), mostraron oligómeros intracelulares y una fuerte alteración de la insulina estimulada por glucosa así como en la secreción de IAPP. Además, la sobreexpresión de hIAPP en ratones y ratas transgénicas desencadena la apoptosis inducida por el estrés de RE en las células ß. En particular, los ratones y ratas transgénicos que expresan IAPP humano específicamente en células ß pancreáticas tienen los marcadores de estrés RE elevados (spliced X-box-binding protein-1; sXBP1, CCAAT/enhancer binding-protein homologous protein; CHOP, active caspase-12, y la acumulación de proteínas ubiquitinadas). La susceptibilidad de las células ß pancreáticas al estrés de RE y a la apoptosis inducida por IAPP nos llevó a explorar potenciales terapias para modular la respuesta de las células ß a factores de estrés de RE inducida por hIAPP, así como en aumentar sus mecanismos de protección con el fin de prevenir la apoptosis, recuperar la función y la disminución de la formación de los depósitos de amiloide en las células ß. En esta tesis, se pretende mejorar el conocimiento sobre el estrés de RE inducido por hIAPP y la posible mejoría por el tratamiento con chaperonas. Nuestra hipótesis es que hIAPP potencia estrés ER, y el tratamiento con chaperonas en modelos de células ß pancreáticas puede resultar en la mejora del estrés de RE inducido por hIAPP y en última instancia disminuir los depósitos de amiloide en los islotes pancreáticos. Estos hallazgos podrían ofrecer nuevas terapias para evitar la pérdida de la masa de células ß asociado con la formación de amiloide en la T2D. En el presente trabajo, hemos establecido inicialmente un modelo de sobreexpresión de hIAPP. Para este propósito, una línea de célula ß pancreática de rata, INS1E, fue transfectada de forma estable con hIAPP (células hIAPP-INS1E), rIAPP (células rIAPP-INS1E) o un vector vacío (células de control INS1E). El primer objetivo del trabajo fue conocer si la sobreexpresión de hIAPP se asocia con alteraciones en los niveles de marcadores de estrés de RE. Nuestro grupo observó previamente que estos clones estables en condiciones normales no mostraron cambios en la expresión de genes implicados en el estrés de RE, así como en la muerte celular. En este contexto, nuestros clones estables fueron expuestos a un inductor químico de estrés llamado tapsigargina. Dosis-respuesta y tiempo de experimentos determinaron las mejores condiciones para inducir un estrés de RE marcada sin la muerte celular excesiva. A continuación, para investigar el efecto de inductores fisiológicos de estrés de RE, las células se cultivaron en alta glucosa y palmitato (HG + PA). Los resultados obtenidos indicaron que la sobreexpresión de hIAPP activa la vía UPR, haciendo que estas células sean más sensibles al estrés que las células rIAPP-INS1E o las células control INS1E. Estos efectos están mediados a través de la regulación positiva de genes implicados en la defensa de las células ß contra el estrés de RE, incluyendo CHOP, ATF3 y sXBP1. Además, se investigó el papel de CHOP en el estrés de RE en respuesta a agentes inductores del estrés de RE, como la thapsigargin y HG + PA. La inhibición de la expresión de siRNA CHOP mostró una disminución en el marcador de apoptosis caspasa-3, como se ejemplifica en los experimentos de inmunohistoquímica. Hemos investigado posteriormente si las chaperonas endógenas y químicas eran capaces de recuperar el estrés de RE y mejorar la secreción de insulina en las células hIAPP-INS1E. Para este propósito, hemos sobreexpressado las chaperonas moleculares BiP y PDI por transducción adenoviral o tratando las células con las chaperonas químicas TUDCA y PBA. Se observó que después de la exposición a HG + PA, las células hIAPP-INS1E tratadas con las chaperonas (BiP, PDI, TUDCA o PBA) mostraron una disminución en los niveles de los marcadores de las proteínas de estrés, ATF3 y p-eIF2a. Además, TUDCA y PBA fueron capaces de reducir el estrés de RE potenciado por hIAPP y tapsigargina. Consecutivamente, hemos investigado el efecto de las chaperonas en la funcionalidad de las células hIAPP-INS1E. Para ello, las células hIAPP-INS1E se dejaron sin tratar o han sido tratadas con Ad-BiP, Ad-PDI y Ad-GFP (como control), TUDCA y PBA y se ha monitoreado su efecto sobre la secreción de insulina estimulada por glucosa. Los resultados realizados en condiciones basales de glucosa mostraron que BiP, TUDCA y PBA fueron capaces de restaurar y mejorar la secreción de insulina cuando comparadas con las células GFP o INS1E control. Curiosamente, la sobreexpresión de PDI parece tener un efecto perjudicial sobre la liberación de insulina, debido a una reducción en el contenido de insulina después de la exposición a la glucosa. A continuación y con el fin de abordar el papel de las chaperonas en condiciones de estrés fisiológicos, las células hIAPP-INS1E fueron expuestos a HG + PA en presencia de las chaperonas. Tal y como esperábamos, HG + PA causó una reducción en la secreción de insulina en las células que expresan hIAPP no transducidas en comparación con las células no tratadas. Con el tratamiento de chaperonas (BIP, PDI, TUDCA y PBA), se observó un re-establecimiento de los niveles de secreción de insulina de una manera similar que las células hIAPP-INS1E no tratados con HG+PA. Para confirmar estos resultados se midió el contenido de insulina de las células hIAPP-INS1E estimulados a 2.8 mM y 16 mM de glucosa, y se observó que los niveles de insulina fueron similares en todos los grupos. El tercer objetivo de este trabajo fue evaluar la efectividad del tratamiento en los islotes pancreáticos de ratones. Para este propósito, hemos sobreexpressado BiP y PDI en los islotes de tipo salvaje (WT) de ratón y en los islotes no-transducidos (CON) a través de una transducción adenoviral y hemos monitoreado la secreción de insulina en condiciones basales de 11 mM de glucosa. Descubrimos que la sobreexpresión de BiP aumenta la secreción de insulina en comparación con Ad-GFP y con los islotes control estimulados con 16 mM de glucosa. Además, la sobreexpresión de PDI no mostró cambios en la secreción de insulina. A continuación, se trataron islotes con las chaperonas químicas TUDCA y PBA. Hemos observado que PBA mejoró significativamente la secreción de insulina estimulada por glucosa en comparación con los islotes controles. Al contrario, el tratamiento con TUDCA no mostró diferencias en la secreción de insulina. Al mismo tiempo, hemos utilizado islotes de ratón transgénicos que sobreexpresan hIAPP (hIAPP Tg) y examinamos los efectos de las chaperonas en la secreción de insulina. La sobreexpresión de BiP aumentó los niveles de secreción de insulina a 16 mM de glucosa en comparación con islotes tratados con Ad-GFP. Se observaron efectos similares en el tratamiento con PBA. En cambio, con la sobreexpresión de PDI y el tratamiento con TUDCA no se observaron alteraciones en la secreción de insulina después de la estimulación con glucosa a pesar de los niveles en el contenido de insulina continuaran siendo similares en todos los grupos. Los mismos experimentos se realizaron en condiciones de HG+PA. Los resultados obtenidos mostraron que BiP y PDI aumentaron significativamente la secreción de insulina estimulada por glucosa cuando comparados con los islotes hIAPP Tg controles que se han cultivado a con HG+PA. Del mismo modo, con el tratamiento con TUDCA y PBA se ha restaurado los niveles de secreción de insulina, alcanzando los valores obtenidos con los islotes control Por último, se examinó si la disminución en el estrés de RE mejora la función de la célula ß y si está correlacionada con una disminución en la formación de amiloide. Después de 7 días de cultivo a 16 mM de glucosa, los islotes no transgénicos y hIAPP Tg mostraron depósitos de amiloide en comparación con islotes no transgénicos y islotes hIAPP Tg cultivados a 11 mM de glucosa (NG) como se muestra por el ensayo de tioflavina S. Después del tratamiento con las chaperonas moleculares (BiP y PDI) en alta glucosa, los resultados demostraron una disminución notable de la formación de amiloide. El mismo efecto inhibidor se observó con el tratamiento de PBA. En contraste, TUDCA mostró una ligera disminución en la formación de amiloide. En resumen, nuestros datos sugieren que el tratamiento con chaperones no sólo mejora el estrés del RE y la secreción de insulina, sino que también desempeña un importante efecto protector en el desarrollo de la formación de amiloide en un modelo de ratón con deposición de amiloide. Nuestros resultados sugieren que los tratamientos con chaperonas se pueden utilizar como una potencial terapia para el enfoque de la mejora del estrés de RE, función de las células ß y en la deposición de amiloide en T2D. En conclusión, nuestro trabajo permitió una mejor comprensión de cómo el estrés de RE afecta la función de la célula ß pancreática en un contexto de sobreexpresión de hIAPP: 1) Células hIAPP-INS1E son más sensibles a los inductores de estrés de RE que las células rIAPP y células control INS1E. 2) La inducción de estrés de RE es dependiente de la activación de CHOP, confiriendo protección a la inducción del estrés y apoptosis en nuestro modelo de células de sobreexpresión de hIAPP. 3) Las chaperonas moleculares y químicas fueron capaces de aliviar el estrés de RE inducida por las células ß que sobreexpresan hIAPP. 4) El tratamiento de con chaperonas ha llevado a una mejora en la secreción de insulina estimulada por glucosa en las células hIAPP-INS1E tanto en condiciones basales y como estresantes. 5) La sobreexpresión de BiP y PDI, así como el tratamiento con PBA potenciaron la capacidad secretora de insulina en los islotes de ratones WT en condiciones basales. 6) La sobreexpresión de BiP y el tratamiento con PBA aumentan la secreción de insulina en los islotes de ratón hIAPP Tg en condiciones normales. 7) BiP, PDI, TUDCA y PBA mejoran la secreción de insulina en el tratamiento con HG y PA en los islotes de ratón hIAPP Tg. 8) El tratamiento con chaperonas reduce la severidad del amiloide en los islotes de ratón hIAPP Tg expuestos a glucose de 16 mM durante 7 días. 9) Por lo tanto, este estudio confirma el papel de la sobreexpresión de hIAPP en el desencadenamiento de la respuesta de estrés de RE y mostró un nuevo mecanismo de protección contra el desarrollo de la formación de amiloide mediante el tratamiento con chaperonas en condiciones fisiopatológicas en un modelo de ratón con deposición de amiloide.

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Islet amylold in type 2 diabetes: The role of chaperones in endoplasmic reticulum stress and amyloid formation in pancreatic β-cell