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Nuevos métodos para el diagnóstico microbiológico de la neumonía

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Universitat de Barcelona. Departament de Fonaments Clínics

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[spa] La neumonía es una de las principales causas de mortalidad a nivel mundial y presenta una gran morbilidad asociada. El correcto diagnóstico de esta infección es crucial para el paciente y, en concreto, el diagnóstico microbiológico es esencial para asegurar un tratamiento antibiótico óptimo. Sin embargo, sólo se consigue determinar la etiología en la mitad de los casos aproximadamente, lo que conlleva un tratamiento inadecuado en muchos casos. Por ello, es necesario el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas que permitan un diagnóstico rápido y adecuado de la neumonía. Los objetivos de esta tesis son diseñar y evaluar ensayos basados en la técnica de amplificación de tipo LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) para la identificación de las principales bacterias y virus implicados en la neumonía intrahospitalaria (NIH), incluida la asociada a la ventilación mecánica (NAVM), diseñar y evaluar ensayos basados en la técnica de amplificación de tipo LAMP para la detección de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en estas bacterias, y evaluar la lipocalina-2 (LCN2) como biomarcador de neumonía. Para cubrir el primer objetivo, se desarrolló y evaluó una LAMP para detectar Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia y Acinetobacter baumannii a partir del ADN extraído mediante un método rápido de muestras de lavado broncoalveolar (LBA), aspirado traqueal (AT) y broncoaspirado (BAS). Además, se desarrolló y evaluó una LAMP para la detección del virus herpes simple-1 (VHS-1) a partir de LBA con y sin extracción de ADN. Por último, se evaluó el papel del citomegalovirus (CMV) en LBA de pacientes críticos y se desarrolló y evaluó una LAMP para su detección. En cuanto al segundo objetivo, se evaluó una LAMP comercial para la detección de genes de resistencia a antibióticos β-lactámicos en Enterobacterales y Acinetobacter spp. tanto a partir de cepas como de muestras respiratorias. Finalmente, como parte del tercer objetivo, se evaluó la utilidad de la LCN2 en plasma y LBA para el diagnóstico de NAVM en un modelo animal porcino. Además, se evaluó la utilidad de la concentración plasmática de LCN2 para determinar la etiología (bacteriana frente a no bacteriana), gravedad y pronóstico de pacientes adultos con neumonía adquirida en la comunidad (NAC) admitidos en Urgencias. La técnica LAMP presentó una elevada sensibilidad y especificidad para detectar los principales microorganismos causantes de NIH (bacterias y virus) de forma barata, rápida, sensible y específica. El sistema comercial basado en LAMP evaluado demostró ser una buena herramienta para la detección de diferentes genes de resistencia a antibióticos β- lactámicos en Enterobacterales así como en Acinetobacter spp. con un tiempo de respuesta rápido. En condiciones de alta concentración de bacterias, el método LAMP presentó buenos resultados cuando se realizó sin un paso previo de extracción de los ácidos nucleicos, reduciendo el tiempo de respuesta. Por otro lado, se observó un aumento de los niveles de LCN2 en los animales que desarrollaban NAVM, especialmente marcado en el LBA. La capacidad de la LCN2 como biomarcador para discriminar la etiología de la NAC fue limitada, pero la concentración de LCN2 se asoció con la gravedad y el ingreso en la Unidad de Cuidados Intensivos en pacientes adultos con NAC. Los trabajos incluidos en esta tesis doctoral podrían contribuir a la mejora del diagnóstico precoz, manejo e identificación de especies causantes de neumonía y, por tanto, al tratamiento óptimo que permitiría la reducción de la morbi-mortalidad asociada.

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[eng] Pneumonia is one of the leading causes of mortality worldwide and has a great associated morbidity. The correct diagnosis of this infection is crucial for the patient and, in particular, the microbiological diagnosis is essential to ensure optimal antibiotic treatment. However, etiology is only known in approximately half of the cases, which leads to inadequate treatment in many cases. Therefore, the development of new diagnostic techniques that allow a rapid and adequate diagnosis of pneumonia is necessary. The objectives of this thesis are to design and evaluate assays based on an isothermal amplification method, LAMP (Loop-Mediated isothermal Amplification), for the identification of the main bacteria and viruses causing hospital-acquired pneumonia (HAP), including ventilation-associated pneumonia (VAP), to evaluate commercial assays based on LAMP for the detection of β-lactam antibiotic resistance genes in these bacteria, and to evaluate lipocalin-2 (LCN2) as a biomarker of pneumonia. To meet the first objective, a LAMP was developed and evaluated to detect Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and Acinetobacter baumannii from bronchoalveolar lavage samples (LBA), tracheal aspirate (AT) and bronchial aspirate (BAS), after a rapid extraction of DNA. In addition, a LAMP was developed and evaluated for the detection of herpes simplex virus-1 (HSV-1) from BAL with and without DNA extraction. Finally, the role of cytomegalovirus (CMV) in BAL in critically ill patients was evaluated and a LAMP was developed and evaluated for its detection. Regarding the second objective, a commercial LAMP was evaluated for the detection of resistance genes to β-lactam antibiotics in Enterobacterales and Acinetobacter spp. both from strains and from respiratory samples. Finally, as part of the third objective, the usefulness of LCN2 in plasma and BAL for the diagnosis of NAVM in a porcine animal model was evaluated. In addition, the usefulness of the plasma concentration of LCN2 was evaluated to determine the etiology (bacterial versus non-bacterial), severity and prognosis of adult patients with community-acquired pneumonia (CAP) admitted to the emergency department. The LAMP technique presented high sensitivity and specificity to detect the main microorganisms causing HAP (bacteria and viruses) in a cheap, quick, sensitive and specific way. The commercial LAMP-based system evaluated proved to be a good tool for the detection of different β-lactam antibiotics resistance genes in Enterobacterales as well as in Acinetobacter spp. with a short response time. Under conditions of high concentration of bacteria, the LAMP method presented good results when it was performed without a previous DNA extraction step, reducing the response time. On the other hand, an increase in LCN2 levels, especially marked in BAL, was observed in animals that developed NAVM. The ability of LCN2 as a biomarker to discriminate the etiology of CAP was limited, but the concentration of LCN2 was associated with severity and admission to the Intensive Care Unit in adult patients with CAP. The research included in this thesis could contribute to the improvement of the early diagnosis, management and identification of species that cause pneumonia and, therefore, to the optimal treatment that would allow the reduction of the associated morbidity and mortality.

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cc by-nc-sa (c) Vergara Gómez, Andrea, 2021

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Tesis Doctorals - Departament - Fonaments Clínics

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Nuevos métodos para el diagnóstico microbiológico de la neumonía