# name
GPR37-ADENOSINE A2A receptor-receptor interaction as a new pharmacological target for Parkinson’s disease treatment

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Universitat de Barcelona. Departament de Patologia i Terapèutica Experimental

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[eng]  GPR37 is an orphan GPCR that belongs to the Rodhopsin family. GPR37 is highly expressed in the Central Nervous System (CNS), while little peripheral expression has been found in humans and rodents. GPR37 is highly distributed in the brain, particularly at the cerebellum, corpus callosum, substantia nigra, striatum and hippocampus with a predominantly neuronal distribution. However, the function of this receptor in the CNS remains unknown. The interest on GPR37 biology was bolstered when it was described as a Parkin substrate. GPR37 was isolated from a human brain library in a yeast 2-hybrid screen for novel interacting partners of Parkin, and thus rebaptized as “Parkin-associated endothelin-like receptor” (Pael-R). Parkin is  of great interest because mutations in this gene are directly linked to autosomal recessive juvenile Parkinsonism (AR-JP). It was found that insoluble GPR37 was increased in patients with AR-JP, linking the aggregation of GPR37 to disease pathogenesis. Later, GPR37 aggregates were also found in a variety of inclusion bodies in brains from patients with PD, dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). All these data suggested a relevant role of the GPR37 in the aggregates formation in the PD. Our working hypothesis is based on that this GPR37 oligomerization with the adenosine and dopamine receptors, together with the neuropathological changes during PD can be relevant during PD development and basal ganglia function, and thus for the PD ethiopatology. Finally, in addition to elucidate GPR37 function in the CNS, in this doctoral thesis we have studied different  specific ligand candidates for this orphan receptor.

RESULTS	
Elucidating the existence and functional consequences of a direct GPR37-A2AR receptor- receptor interaction in the striatum. Two polyclonal antibodies which recognized the extracellular N-terminal or the intracellular C-terminal fragment of GPR37 respectively were produced by the immunization of rabbits (strain New Zealand White) in the Animal house facilities in the Bellvitge Health Sciences Campus. The results obtained by Western Blot using the antibody against the N-terminal region of the GPR37 receptor was a single specific band of about 53 kDa, similar to the theoretical weight calculated for the receptor peptidic chain. On the other hand, the result obtained by Western Blot using the antibody against the C-terminal region of the GPR37 receptor was a single specific band of about 40 kDa, an unexpected result since the expected size of the complete GPR37 receptor is approximately 53 kDa. Our results confirmed this N-terminal cleavage of the receptor in native tissue. In our work, we studied with special emphasis the physical and functional interaction between the GPR37 and A2AR receptor in native tissue, specifically in striatum. First, we verified the presence, co-distribution and direct interaction of GPR37 and A2AR by different methods: i) Through histoblot and immunohistochemistry (IHC) we confirmed that the two receptors co-distribute in the  striatum.
 
ii) Next, by means of electron microscopy and the technique of subsynaptic fractionation we characterized the subsynaptic distribution of these receptors in the striatum, observing that both receptors were enriched at the postsynaptic level. iii) Using co-immunoprecipitation (Co-ip), the proximity ligation assay (PLA) technique and double labeling with gold immunoparticles (in collaboration with Prof. Rafael Luján, UCLM, Albacete), we demonstrated the direct interaction between both receptors in the striatum. Subsequently, we analyzed the impact of the presence/ absence of GPR37 on the expression and functionality of A2AR. Interestingly, GPR37 deletion promoted an increase in A2AR membrane expression in the striatum observed by biotinylation of membrane proteins performed on corticostriatal slices. On the other hand, we determined the generation of A2AR-mediated cAMP after stimulation with CGS21680, a selective agonist of  this receptor, in total synaptosomes and primary cultures of striatum. Interestingly, the results showed a greater effect of the A2AR agonist on GPR37-/- mice when compared with the Gpr37+/+ mice. In addition, we performed behavioral tests to analyze striatal-dependent functions (i.e. locomotor activity) to assess the relevance of GPR37 receptor and its impact on A2AR function by administering SCH58261 (3.75mg/kg, intraperitoneal, i.p.), a selective A2AR receptor, in GPR37+/+ and GPR37-/- mice. In the Open field test, mice freely explored the field. The horizontal locomotor activity (total distance traveled) was analyzed and a greater increase of the spontaneous locomotor activity in the GPR37-/- animals treated with SCH58261 was observed. Finally, we characterize the role of GPR37 in an animal model of PD, and its relation with the adenosinergic transmission. PD is characterized by a degeneration of the nigrostriatal dopaminergic neurons, resulting in an imbalance of the function of the basal ganglia. Pharmacological treatment of PD is mainly based on improving dopaminergic transmission (either by enhancing the release of dopamine or by directly activating dopamine receptors). However, severe side effects appear after prolonged treatment, including dyskinesias and somnolence. During the last decades, the A2AR antagonists have been studied as a good alternative or supplementation (together with the classical dopaminergic drugs) for the treatment of PD. A2AR antagonists mechanism, is based on the interaction between these receptors and the D2R in the striatum. For example, A2AR antagonists attenuate catalepsy induced by D2R blockade in rodents. In addition, this catalytic effect can also be induced by the administration  of A2AR agonists at high doses. We used the pharmacological catalepsy model to evaluate the impact of the presence of GPR37 on the adenosinergic transmission in the striatum. First, we administered haloperidol, a D2R antagonist, together with SCH58261, and quantified the duration of the cataleptic effect. Next, we used the CGS21680, a selective A2AR agonist, administered intracerebroventricularly (i.c.v.), to cause the cataleptic effect. The results showed an increase in the cataleptic response in GPR37-/- animals which would correlate with  an increase in the A2AR expression in the synapse previously observed.

In order to study the role of this orphan receptor in CNS synaptic plasticity and to evaluate its involvement in A2AR receptor function, we performed behavioral experiments related to striatal functions in GPR37+/+ and GPR37-/- mice of 2 months old mice administered chronically with SCH58261 (1mg/kg, i.p. for 14 days). Thus, we performed the following behavioral tests: i) Open field test and ii) Modified Water maze test. These tests allowed us to evaluate locomotor activity and learning memory, respectively. Subsequently, extracellular field electrophysiological recordings were performed on corticostriatal slices to evaluate possible changes in the synaptic activity and plasticity of these animals, and their relationship with GPR37 receptor or chronic treatment with the A2AR antagonist. In conclusion, the results obtained in the behavioral experiments and LTD electrophysiological records performed in corticostriatal slices, made us hypothesize that in the absence of the GPR37 receptor, sensitization to A2AR receptor antagonists occurs, due to differences in the levels of this receptor in the membrane. This would coincide with our results previously obtained in the laboratory, where using techniques such as biotinylation of membrane receptors or subsynaptic fractionation, where we can quantify the amount of receptors in pre- and postsynaptic densities, we observed an increase in A2AR receptor expression in the plasma membrane in the Gpr37 - / - animals.
 
Establishing the existence of GPR37-A2AR in other brain areas, such as the hippocampus, describing the synaptic distribution of GPR37 and determining its role in A2AR-mediated synaptic plasticity. The results obtained with this work described the presence of this orphan receptor in the hippocampus and a preferably postsynaptic location in the neurons. In addition, a series of behavioral tests related to hippocampal dependent functions (i.e. anxiety and memory) were also performed to evaluate the relevance of the GPR37. We also evaluated the interaction of GPR37 with the A2AR by administering SCH58261. Novel Object Recognition (NOR) test, widely used to study effects on memory. On the other hand the Marble Burying Test (MBT) and the Elevated Plus Maze (EPM) were performed to evaluate the anxiety. The results obtained coincide with previous studies, which showed that the deletion of A2AR has an anxiogenic effect and that overexpression leaded to a less anxious phenotype.

Evaluating GPR37 receptor expression levels in PD and the potential use of this receptor  as a PD biomarker. The expression/ recycling of GPR37 in some types of PD is altered, triggering an increase and accumulation of this receptor in neurons. In this objective, we intend to describe whether this process occurs only in an isolated group of PD patients (AR-JP, a genetic cause) or if it was a more widespread process in PD, thus being able to describe its histopathological evolution through the different stages of the disease. In addition, this increase of the GPR37 receptor in the tissues of the CNS could translate into an increase in the presence of the receptor or fragments of this receptor in body fluids such as blood or cerebrospinal fluid (CSF). This process is known for other proteins such as α-synuclein, Phospho-Tau, β-amyloid, related CNS diseases. At this moment we are currently completing the validation of a system for the detection of the ecto-GPR37 receptor (a N-terminal fragment of the GPR37 produced and liberated after metalloproteinase cleavage) in CSF which could be used as a new biomarker for earlier and finer diagnosis in PD.

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[spa]  INTRODUCCIÓN	
GPR37 es un receptor huérfano acoplado a proteína G que se encuentra casi exclusivamente en el sistema nervioso central (SNC), enriquecido en áreas tales como el cerebelo, cuerpo calloso, bulbo raquídeo, putamen, núcleo caudado, sustancia negra e hipocampo. Sin embargo, la  función de este receptor en el SNC es aún desconocida. El interés por GPR37 se basa en su identificación, hace unos pocos años, como sustrato de Parkin. Parkin es una ubiquitina ligasa E3 proteasomal que participa en la ubiquitinación y la degradación/eliminación de proteínas mal plegadas. Esta pérdida de función es característica de la enfermedad de Parkinson Juvenil (AR- JP), en la que se produce una mutación en Parkin y consecuentemente una pérdida parcial de su función. Tal pérdida conduce a una acumulación tóxica de los sustratos de Parkin (como GPR37). Además, se ha descrito la sobreexpresión de GPR37 en cerebros de pacientes de AR- JP, así como su presencia en el núcleo de los cuerpos de Lewy de pacientes de la Enfermedad de Parkinson (EP). Estos hechos sugieren un papel importante de los agregados de GPR37 en la EP. Nuestra hipótesis de trabajo se basa en que la oligomerización del receptor GPR37 con receptores de adenosina y dopamina, así como los cambios que se producen durante la enfermedad, es relevante para la función de los ganglios basales y por tanto en la etiopatología de la EP. Finalmente, cabe añadir que además de elucidar la posible función de GPR37 en el SNC, en la presente tesis doctoral hemos intentado también encontrar un ligando específico de este receptor huérfano.

RESULTADOS	
Establecer el papel del GPR37 en el estriado y su impacto sobre la función del A2AR. En esta tesis doctoral, se han desarrollado en el laboratorio dos nuevas herramientas para la detección y estudio del receptor huérfano GPR37: un anticuerpo policlonal producido en conejo (cepa New Zealand White) que reconoce el fragmento N-terminal y otro anticuerpo que  reconoce el fragmento C-terminal de este receptor. El resultado obtenido en el Western Blot usando el anticuerpo contra la región N-terminal del receptor GPR37 fue una única banda específica de aproximadamente unos 53 kDa, similar al peso teórico calculado para la cadena peptídica del receptor. Por otro lado, el resultado obtenido en el Western Blot usando el anticuerpo contra la región C-terminal del receptor GPR37 fue una única banda específica de aproximadamente unos 40 kDa, hecho sorprendente ya que el tamaño esperado del receptor completo GPR37 es de aproximadamente 53 kDa. En paralelo a este hallazgo, fue publicado un artículo en el que se describía la acción de unas metaloproteasas sobre este receptor en un sistema de expresión heterólogo, cortando al receptor GPR37 en su dominio N-terminal extracelular. Nuestros resultados confirman este hecho, pero además incrementan la discusión sobre dónde actúan estas metaloproteasas y de si tienen solo un punto o varios de corte en el dominio extracelular del receptor ya que la diferencia entre el receptor entero y el cortado sería de unos 20 kDa. Además, el hecho de detectar una única banda de unos 40 kDa con  el anticuerpo GPR37 que reconoce el epítopo intracelular indica que el receptor se encuentra principalmente cortado.
 
En nuestro trabajo, hemos estudiado con especial énfasis la interacción física y funcional entre el receptor GPR37 y A2AR en tejido nativo, concretamente en estriado. En primer lugar, comprobamos la presencia, co-distribución e interacción directa del GPR37 y A2AR por diferentes métodos: i) Mediante histoblot e inmuohistoquímica (IHC) confirmamos que los dos receptores co-distribuyen en el estriado. ii) Mediante microscopia electrónica y la técnica de fraccionamiento subsináptico determinamos la distribución subsináptica de estos receptores en el estriado, observando que ambos receptores están enriquecidos a nivel postsináptico. iii) Mediante co-immunoprecipitación, la técnica proximity ligation assay (PLA) y doble marcaje con inmunopartículas de oro para la observación mediante microscopia electrónica, en colaboración con el Prof. Rafael Luján (UCLM, Albacete), demostramos la interacción directa entre ambos receptores en el estriado. Posteriormente, hemos analizado el impacto de la presencia/ausencia de GPR37 en la expresión y funcionalidad del A2AR. De forma interesante, mediante biotinilización de las proteinas de membrana realizado en rodajas corticoestriatales, se observó un incremento de la expresión en membrana del A2AR en ausencia de GPR37 en el estriado. Por otro lado, determinamos la generación de AMPc mediada por A2AR tras la estimulación con CGS21680, un agonista selectivo de este receptor en sinaptosomas totales y cultivos primarios de estriado. De forma interesante, los resultados muestran un mayor efecto del agonista A2AR en los animales GPR37-/- respecto a los GPR37+/+, reforzando nuestros resultados previos obtenidos en células HEK293T (no se muestran los datos).

Además, también se realizaron tests de conducta relacionados con funciones dependientes del estriado (actividad locomotora) para evaluar la relevancia del receptor GPR37 y su impacto sobre la función del A2AR administrando SCH58261 (3.75mg/kg, intraperitoneal, i.p.), un antagonista selectivo del receptor A2AR, en ratones GPR37+/+ y GPR37-/-. El test empleado fue el test de campo abierto, que consiste en exponer a los animales, durante un periodo de 10 minutos en condiciones de luz tenue a un campo de 30x30cm. Durante este periodo, los ratones exploran libremente el campo. La actividad locomotora horizontal (distancia total recorrida) fue analizada observándose un mayor aumento de la actividad locomotora espontanea en los animales GPR37-
/-. Finalmente, caracterizamos la función del GPR37 en un modelo de la EP y su relación con la transmisión adenosinérgica. La EP está caracterizada por una degeneración de las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales, que resulta en un desequilibro de la función de los ganglios basales. El tratamiento farmacológico de la EP se basa principalmente en la mejora de la transmisión dopaminérgica (ya sea potenciando la liberación de dopamina o activando directamente los receptores de dopamina). Sin embargo, efectos secundarios severos aparecen tras el tratamiento prolongado, entre los cuales se incluyen disquinesias y somnolencia. Los antagonistas A2AR se han estudiado desde ya hace un tiempo como una buena alternativa/complementación para el tratamiento de la EP. Su empleo se basa en la interacción entre estos receptores y los D2R en el estriado. Por ejemplo, los antagonistas del A2AR atenúan  la catalepsia inducida por el bloqueo de D2R en roedores. Además, este efecto cataléptico también puede inducirse mediante la administración de agonistas del A2AR a dosis elevadas. Utilizamos el modelo de catalepsia inducida farmacológicamente para evaluar el impacto de la presencia del GPR37 en la transmisión adenosinérgica en el estriado. Primero, administramos haloperidol, un antagonista D2R, juntamente con SCH58261, antagonista A2AR, y se cuantificó la duración del efecto cataléptico. Los resultados obtenidos no fueron suficientemente claros debido a que el ratón GPR37-/- tiene alterada la transmisión dopaminérgica, así decidimos usar el CGS21680, agonista A2AR, administrado intracerebroventricularmente (i.c.v.), para causar el efecto cataléptico. Los resultados muestran un incremento en la respuesta cataléptica en los animales GPR37-/-. Este hecho coincide con los resultados obtenidos por fraccionamiento subsináptico, en los que también se observó un incremento en la expresión del A2AR en la sinapsis.

Con el fin de estudiar la función del receptor huérfano GPR37 en la plasticidad sináptica del SNC, y evaluar su implicación en la función del receptor A2AR, realizamos experimentos conductuales relacionados con funciones estriatales en ratones GPR37+/+ y GPR37-/- de 2  meses
 
de edad administrados con SCH58261 (1mg/kg, i.p.) durante 14 días. La dosis del antagonista A2AR, fue elegida en base a experimentos previos realizados en nuestro grupo, donde se observó que una administración aguda de este fármaco a esta concentración, no producía una alteración de la actividad locomotora. Así, realizamos las siguientes pruebas conductuales: i) Test de campo abierto y ii) Test de Water maze modificado. Estos test nos permitieron evaluar la actividad y el aprendizaje locomotor, respectivamente. Posteriormente, se realizaron experimentos de electrofisiología en rodajas corticoestriatales para evaluar posibles cambios en la actividad y plasticidad sinápticas de estos animales, y su relación con receptor GPR37 o al tratamiento crónico con el antagonista A2AR. En conclusión, los resultados obtenidos en los experimentos de conducta y registros electrofisiológicos de LTD realizados en rodajas corticoestriatales, nos hacen hipotetizar que en ausencia del receptor GPR37, ocurre una sensibilización a antagonistas del receptor A2AR, debido a diferencias en los niveles de este receptor en la membrana. Esto coincidiría con nuestros resultados obtenidos previamente en el laboratorio, donde usando técnicas como biotinilización de receptores de membrana o fraccionamientos subsinápticos, donde podemos cuantificar la cantidad de receptores en las densidades pre- y postsinápticas, hemos observado un incremento en la expresión del receptor A2AR en la membrana plasmática en los animales Gpr37-/-.

Caracterizar la función del GPR37 en el hipocampo y su relación con la transmisión adenosinérgica. Con la finalidad de estudiar la presencia y localización del receptor GPR37 en el hipocampo, realizamos cultivos primarios y fraccionamiento subsináptico de hipocampo para determinar la localización de este receptor en las neuronas, donde se observó la presencia de  este receptor huérfano en el hipocampo y una localización preferentemente postsináptica en las neuronas. Además, también se realizaron una serie de tests de conducta relacionados con funciones dependientes del hipocampo (ansiedad y memoria) para evaluar la relevancia del receptor GPR37. Igualmente, evaluamos la interacción de GPR37 con el A2AR administrando SCH58261, un antagonista selectivo de este último receptor. El primer test empleado fue el test de Novel Object Recognition (NOR), ampliamente utilizado para estudiar efectos sobre la memoria. Este test consta de dos sesiones, en la primera se le presentan dos objetos iguales al ratón (fase de familiarización) y dos horas después se realiza otra sesión presentándole un objeto nuevo (fase de evaluación). Basándose en el tiempo de exploración de cada objeto (objeto familiar vs nuevo) se calcula el % de preferencia por el objeto nuevo (tiempo de exploración del objeto nuevo/tiempo de exploración total). En el NOR no se observaron diferencias entre los animales GPR37+/+ y GPR37-/- en la retención de memoria pero sí una potenciación del efecto   de SCH58261. Para evaluar otras características emocionales como la ansiedad realizamos el Marble Buring Test (MBT) y el Elevated Plus Maze (EPM). El MBT consiste en evaluar una conducta innata en los animales como es el excavar/enterrar ya sea como una respuesta defensiva ante un objetivo que les produce miedo o para proteger la comida de otros depredadores. En este test se le presentan al ratón 9 canicas colocadas equidistantemente y a los 30 minutos se contabilizan el número de enterradas. Los resultados obtenidos muestran que los ratones GPR37+/+ enterraron más canicas que los GPR37-/-, pudiéndose interpretar como un fenotipo menos ansioso en los animales GPR37-/-. Además al administrar el SCH este fenotipo  se revirtió, confirmando la interacción de GPR37 con el A2AR. Los resultados obtenidos coinciden con estudios realizados anteriormente, en los que se demostró que la deleción del A2AR tiene un efecto ansiogénico que la sobreexpresión conduce a un fenotipo menos ansioso. Finalmente, el test más ampliamente utilizado para evaluar ansiedad es el EPM. El EPM consiste en colocar al ratón durante 10 minutos en un aparato en forma de cruz con dos de sus brazos abiertos y dos cerrados, elevado a 40 centímetros del suelo y se contabiliza el tiempo explorando los brazos abiertos. Mediante este test se evalúa la actividad exploratoria de los ratones en un instrumento con dos ambientes, uno más estresante que otro ya que los brazos cerrados ofrecen un entorno menos estresante y expuesto que los abiertos. De esta manera una mayor exploración de los brazos abiertos indica un estado menos ansioso del animal. En el EPM se observó una mayor exploración de los brazos abiertos en los animales GPR37-/- que en los GPR37+/+. Además, al administrar el antagonista del A2AR se reprodujo un efecto ansiogénico del fármaco en los animales GPR37-/-.
 
Caracterizar los niveles de GPR37 en diferentes etapas de la enfermedad de Parkinson. Como ya se ha dicho con anterioridad, la expresión/reciclaje del GPR37 en algunos tipos de EP se encuentra alterada, desencadenando un incremento y acúmulo de este receptor en las neuronas. En este objetivo pretendemos describir si este proceso sólo ocurre de manera aislada en la AR-JP (causa genética) o si se trata de un proceso más extendido en la EP de origen idiopático, pudiendo así describir su evolución histopatológica en las diferentes etapas de la enfermedad. Además, este incremento del receptor GPR37 en los tejidos del SNC podría traducirse en un incremento en la presencia del mismo, ya sea en su totalidad o fragmentados de este receptor, en fluidos del cuerpo como la sangre o el líquido cefaloraquídeo (CSF). Este proceso es conocido para otras proteínas como la α-sinucleina, Phospho-Tau, β-amyloid, relacionadas con enfermedades del SNC. Actualmente, estamos acabando la validación de un sistema para la detección del receptor GPR37 en CSF. Si éste fuera el caso, podría usarse como un nuevo biomarcador para un diagnóstico precoz y más fino en la EP.

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Tesis Doctorals - Departament - Patologia i Terapèutica Experimental

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GPR37-ADENOSINE A2A receptor-receptor interaction as a new pharmacological target for Parkinson’s disease treatment