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Targeting non-canonical p38 MAPK signalling: discovery and characterization of novel allosteric p38α inhibitors

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Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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[eng] Non-canonical activation of p38α MAPK has been associated to cardiomyocyte death in several cardiovascular pathologies, such as myocardial ischaemia-reper- fusion injury. Unfortunately, current p38α inhibitors are mainly ATP-competitors, which have not progressed in clinical trials. Efforts to discover novel allosteric p38α inhibitors are crucial to overcome potential side effects that undermine their therapeutic efficacy. By running an in silico small molecule drug discovery program to target the non-canonical site on p38α, we have identified several compounds, named NC-p38i, which inhibit both TAB1-induced and spontaneous p38α autophosphorylation in vitro. Additionally, NC-p38i do not inhibit canonical MAP2K-dependent p38α activation but slightly impair its ability to phosphorylate substrates. A combination of biophysical and structural studies has allowed us to characterize their mechanism of action. NC-p38i do not interfere with the binding of TAB1 to p38α in vitro but modulate the ATP-binding site and the prone-to-au- tophosphorylate conformation of the kinase. Nuclear magnetic resonance and X-ray crystallography data suggest that NC-p38i probably bind to several sites on p38α, including the active site and the N-terminal domain, which may induce structural rearrangements that reduce its autoactivation capacity. Cell based assays show that NC-p38i decrease ischaemia-reperfusion-induced cardio- myocyte death both under prophylactic and therapeutic conditions. Moreover, these compounds ameliorate doxorubicin-induced cardiac toxicity in human iPSC-derived cardiomyocytes and zebrafish models. Importantly, NC-p38i are quite specific at inhibiting p38α but not a number of other protein kinases, and possess good drug-like properties, including weak cardiac hERG K+ channel inhibition and low cytotoxic effects. Together, our data identify NC-p38i as novel allosteric p38α inhibitors with promising cardioprotective effects, which may serve as a good starting point to develop clinical candidates for treating non-canonical p38α signalling associated diseases.

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[spa] La activación no canónica de p38α MAPK se ha asociado con la muerte de los cardiomiocitos en varias patologías cardiovasculares, como el daño miocárdico producido por isquemia-reperfusión. Desafortunadamente, los inhibidores de p38α actuales son principalmente competidores de ATP, y no han progresado  en los ensayos clínicos. Por tanto, resulta crucial descubrir nuevos inhibidores alostéricos de p38α para evitar los potenciales efectos secundarios que reducen su eficacia terapéutica. En este trabajo, hemos desarrollado un programa in silico de descubrimiento de fármacos para diseñar compuestos que se puedan unir al sitio no canónico en p38α. Hemos identificado varias moléculas, denominadas NC-p38i, que inhiben la autofosforilación de p38α tanto inducida por TAB1 como espontánea in vitro. Además, los NC-p38i  no  inhiben  la  activación  canónica de p38α dependiente de MAP2K, aunque afectan ligeramente la capacidad de p38α para fosforilar sustratos. La combinación de estudios biofísicos y estruc- turales nos ha permitido caracterizar su mecanismo de acción. Los NC-p38i no interfieren con la unión de TAB1 a p38α in vitro, pero alteran el sitio de unión del ATP y la conformación propensa a la autofosforilación de la quinasa. Los datos de resonancia magnética nuclear y de cristalografía de rayos X sugieren que   los NC-p38i podrían unirse a varios sitios en p38α, incluido el sitio activo y el dominio N-terminal, lo que puede inducir alteraciones estructurales que reducen su capacidad de autoactivación. Ensayos celulares muestran que los NC-p38i reducen la muerte de los cardiomiocitos inducida por isquemia-reperfusión tanto en condiciones preventivas como terapéuticas. Además, estas moléculas mejoran la toxicidad cardiaca inducida por doxorrubicina tanto en cardio- miocitos humanos derivados de iPSCs como en pez cebra. Cabe destacar que los NC-p38i inhiben principalmente a p38α pero no a otras proteína-quinasas, y que poseen buenas propiedades farmacológicas, incluyendo una inhibición débil del canal hERG K+ cardiaco y una citotoxicidad reducida. En conjunto, nuestros datos caracterizan a los NC-p38i como nuevos inhibidores alostéricos de p38α con efectos cardioprotectores prometedores, y que pueden servir como punto de partida para desarrollar candidatos clínicos utilizables en el tratamiento de enfermedades asociadas a la señalización no canónica de p38α.

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Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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Targeting non-canonical p38 MAPK signalling: discovery and characterization of novel allosteric p38α inhibitors