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Metabolismo lipídico en "Arabidopsis thaliana": Caracterización de mutantes "arv" y de las isoenzimas farnesildifosfato sintasa citosólicas

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[spa] Los estudios realizados sobre las proteínas Arv indican que estaría involucrada en la regulación de la homeostasis de esteroles y esfingolípidos. En levadura se observó una posible función en la síntesis de GPI (Kajiwara et al., 2008) y respecto a su topología, posee 3 dominios hidrofóbicos con el extremo N-terminal orientado hacia el citosol (Villasmil y Nickels 2011). En plantas, se caracterizaron los genes AtARV1 y AtARV2 de Arabidopsis thaliana que codifican dos proteínas de RE funcionales, AtArv1 y AtArv2. Estas comparten una identidad del 66% entre sí y poseen un dominio N-terminal AHD muy conservado en diferentes especies. Ambos genes poseen patrones solapantes de expresión en tejidos meristemáticos, excepto en hojas donde AtARV2 no se expresa (Forés et al., 2006). En este trabajo se determinó que AtArv1 posee un número par de dominios hidrofóbicos y que los extremos N- y C-terminales están orientados hacia el citosol. Además, se caracterizaron mutantes simples con pérdida de función (arv1) y dobles (arv1:arv2), que si bien no mostraron alteraciones fenotípicas, la activación de un RNAi en los doble mutantes arv1:arv2 indica que la pérdida de AtArv produce alteraciones fenotípicas en plántulas, que presentan acortamiento de la raíz y de los cotiledones que se vuelven amarillentos y se curvan en forma de « punta de flecha ». Los niveles de esteroles disminuyen y se ven incrementadas algunas BECL (Bases Esfingoides de Cadena Larga). Por otro lado, AtArv1 no parece estar vinculada a la UPR (Unfolded Protein Response) y su pérdida no es capaz de activar esta respuesta.
La farnesildifosfato sintasa (FPS) es una enzima dimérica que cataliza la condensación de una molécula de dimetilalildifosfato con dos moléculas de isopentenildifosfato para dar lugar a farnesildifosfato, que es el punto de partida para la síntesis de isoprenoides en el citosol y las mitocondrias. Los genes FPS1 y FPS2 de Arabidopsis thaliana codifican las isoenzimas FPS1L mitocondrial), FPS1S y FPS2. Las secuencias aminoacídicas de FPS1S y FPS2 poseen una identidad del 90.6% y difieren en sólo 32 aminoácidos. El gen FPS1 se expresa de forma generalizada durante todo el desarrollo de la planta, en cambio, FPS2 muestra un patrón de expresión restringido a órganos florales, semillas y estadios tempranos de la germinación. En la caracterización de los mutantes nulos de Arabidopsis fps1 y fps2 se observó que el gen FPS2 es más importante en las semillas y las etapas tempranas de la germinación. La isoenzima FPS2 contribuye entre un 70-80% a la actividad FPS total en semillas maduras. Como consecuencia, las semillas del mutante fps2 presentan niveles reducidos de sitosterol, un aumento de la actividad HMG-CoA reductasa (HMGR) e hipersensibilidad a la mevastatina (Closa et al., 2010). En este trabajo se ha determinado mediante ensayos bioquímicos, que la isoenzima FPS2 es catalíticamente más eficiente, más sensible al efecto inhibitorio del NaCl, y termodinámicamente más estable que FPS1S. También se ha demostrado la localización citosólica de ambas isoenzimas. Los patrones de expresión de los genes FPS1 y FPS2 son complementarios en semilla e indican que el FPP necesario para el desarrollo de las semillas tiene dos posibles orígenes separados en el espacio y en el tiempo. Por último, los estudios de complementación funcional en semillas del mutante fps2 demuestran que en condiciones normales FPS1S y FPS2 son funcionalmente intercambiables.

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[eng] The previously characterized Arabidopsis thaliana proteins AtArv1 and AtArv2 have been suggested to be involved in the regulation of cellular lipid homeostasis as demonstrated for their yeast and mammalian counterparts. In this study, we established the citosolic orientation of both N- and C-terminal ends of the AtArv1 protein in the yeast ER membrane. Functional complementation assays of an arv1Δ yeast strain with a truncated AtArv1 protein also showed that the C-terminal 31 aminoacids are essential for AtArv1 function. Characterization of single Arabidopsis arv mutants did not reveal any effect on plant phenotype. On the contrary, characterization of loss-of-function Arabidopsis arv1:arv2 double mutants obtained by inducible siRNA-mediated silencing of AtARV genes demonstrated that lack of AtArv function leads to reduced root lenght and pale green curved cotiledons as well as to reduced levels of major sterols and increased levels of some sphingolipid LCBs (Long Chain Bases). In contrast to S. cerevisiae Arv1p, AtArv is not involved in the UPR (Unfolded Protein Response) in Arabidopsis since lack of AtArv1 does not activate this response.
Previous results obtained in our laboratory showed that Arabidopsis thaliana contains two genes encoding farnesyl diphosphate (FPP) synthase (FPS), the short-chain prenyl diphoshate synthase that catalyzes the synthesis of FPP from isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP). The FPS1 gene is widely expressed in all plant tissues throughout development, whereas FPS2 shows a pattern of expression restricted to specific floral organs, developing and mature seeds. Characterization of fps single knock-out mutants suggested that FPS2 has a major role in seeds and during the early stages of seedling development. Actually, FPS2 provides 70-80% of total FPS activity in mature Arabidopsis seeds, hence lack of FPS2 activity in seeds leads to a marked reduction in sitosterol content and a positive feedback regulatory response of HMG-CoA reductase (HMGR) activity that renders seeds hypersensitive to mevastatin. In this study, we provide evidence that the two Arabidopsis short FPS isozymes FPS1S and FPS2 localize to the cytosol. Biochemical characterization of these recombinant enzymes expressed in E. coli, revealed that, despite FPS1S and FPS2 share more than 90% amino acid sequence identity, FPS2 is more efficient as a catalyst, more sensitive to the inhibitory effect of NaCl, and more resistant to thermal inactivation than FPS1S. Expression analysis of FPS::GUS genes in seeds also showed that FPS1 and FPS2 display complementary patterns of expression particularly at late stages of seed development, which suggests that developping Arabidopsis seeds have two spatially segregated sources of FPP. Functional complementation studies of the fps2 knock-out mutant seed phenotypes demonstrated that at least under normal conditions FPS1S and FPS2 are functionally interchangeable.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Metabolismo lipídico en "Arabidopsis thaliana": Caracterización de mutantes "arv" y de las isoenzimas farnesildifosfato sintasa citosólicas