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Exploring molecular mechanisms of key targets in metabolic and infectious diseases

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Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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[eng] This doctoral thesis is focused on disclosing molecular factors that regulate the functional mechanism of key targets in i) metabolic disorders, such as diabetes and obesity, and ii) tuberculosis (TB). These diseases have a high impact on the public health, and TB is one of the diseases that causes highest mortality rates based on the World Health Organization reports. Accordingly, gaining insight on functionally relevant protein structures with key roles in these diseases and understanding their regulatory mechanisms can pave a way to identify novel therapeutic targets.

Regarding the metabolic disorders, I have specifically studied the direct activation mechanism of adenosine-monophosphate activated protein kinase (AMPK) by different activators, such as A-769662, SC4 and PF-739, since AMPK plays an important role in cellular energy homeostasis and it is directly related to diabetes type 2 and obesity. These studies were carried out to explore the molecular basis of the selective isoform activation of AMPK, especially focusing on the role played by the two different isoforms of β subunit. The first part of this research was focused on the direct activation by A-769662 compound in α2β1 isoform, and the second part addressed the important issue of isoform selectivity, it being dedicated to examine the structural and dynamical properties of β1- and β2-containing AMPK complexes formed with A-769662, SC4 and PF-739. The results revealed the mechanical sensitivity of the α2β1 complex, in contrast with a larger resilience of the α2β2 species. Moreover, binding of activators to α2β1 promotes the pre-organization of the ATP-binding site, favoring the adoption of activated states of the enzyme.

In another part of the research related to AMPK, in collaboration with Prof. Ana Castro from Institute of Medicinal Chemistry and Prof. María S. Fernández-Alonso from Complutense University of Madrid, I studied a novel indolic compound synthesized and experimentally analysed by their group as modulator of endothelial AMPK that acts as a mixed-type inhibitor. It means that this modulator, IND6, may bind the ATP-binding site leading to competitive inhibition of the enzyme but also suggest that IND6 may regulate the AMPK activity through binding to an additional pocket.

Regarding TB, I have studied the truncated hemoglobin N (trHbN) of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). These studies aimed to disclose innovative therapeutic approaches by identifying the molecular basis of the nitrosative stress resistance of Mtb. Our hypothesis was that a decrease in the nitric oxide (NO) resistance should affect the survival of the bacillus, increasing the efficacy of current therapeutic treatments. Nitric oxide detoxification (NOD) is carried out by trHbN, which converts NO into the harmless nitrate anion, becoming essential for the defense mechanism of Mtb. However, two points prevent the use of this system as therapeutic target. On the one side, trHbN is not druggable and there is the risk that a drug targeting trHbN may also affect other hemoglobins. On the other side, the reductase protein that helps trHbN to restore the ferrous state required to initiate the NOD is still unknown. Our studies have led to the identification of three reductase candidates for NOD activity. We have built the 3D models for the three candidates and performed the protein-protein docking in order to obtain a reductase-trHbN complex. The important role played by one of these candidates, ndh, has been highlighted in several experimental studies. This led us to focus our attention in the trHbN-ndh complex and establish the steps that could help to advance in the definition of new therapeutic strategies for TB.

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[spa] Esta tesis doctoral se centra en el análisis de los factores moleculares que regulan el mecanismo funcional de dianas  clave  en:  i)  trastornos   metabólicos,   como  diabetes  y  obesidad,  y  ii)  tuberculosis   (TB).  Estas enfermedades  tienen  un  elevado  impacto  en  la  salud  pública,  y  en  particular  la  TB  se  halla  entre  las enfermedades con una mayor tasa de mortalidad según los informes de la Organización Mundial de la Salud. Por  lo  tanto,  conocer  las  estructuras  proteicas  que  tienen  una  función  clave  en  estas  enfermedades  y comprender   sus   mecanismos   reguladores   puede   allanar   el  camino   para   identificar   nuevos   objetivos terapéuticos.
Respecto a los trastornos metabólicos, he estudiado el mecanismo de activación directa de la proteína quinasa activada por adenosina-monofosfato  (AMPK) por diferentes activadores, como A-769662, SC4 y PF-739, ya que AMPK juega un papel importante  en la homeostasis  energética  celular y está directamente  relacionada con diabetes tipo 2 y obesidad. Estos estudios se llevaron a cabo con el objetivo de explorar los factores moleculares  que regulan  la activación  selectiva  de isoformas  de AMPK,  centrándome  especialmente  en el papel que desempeñan las dos isoformas de la subunidad β. La primera parte de esta investigación se centró en la activación  directa  por el compuesto  A-769662  en la isoforma  α2β1,  y la segunda  parte se dedicó  a examinar la base molecular de la selectividad entre isoformas, considerando específicamente  las propiedades estructurales  y dinámicas  de los complejos  de AMPK  que contienen  isoformas  β1 y β2 formados  con A-
769662, SC4 and PF-739. Los resultados revelaron la sensibilidad mecánica del complejo α2β1, en contraste con  una  mayor  resiliencia  de la especie  α2β2.  Además,  la unión  de los activadores  en la isoforma  α2β1 promueve la organización previa del sitio de unión de ATP, favoreciendo la adopción de estados activados de la enzima.
Asimismo,  en colaboración  con la Prof. Ana Castro  del Instituto  de Química  Médica  y la Prof. María  S. Fernández-Alonso de la Universidad Complutense de Madrid, estudiamos un novedoso compuesto indólico sintetizado y analizado experimentalmente  por sus grupos, que actúa como inhibidor de tipo mixto y es capaz de modular el AMPK endotelial. Nuestros cálculos sugieren que este modulador, IND6, puede unirse al sitio de unión de ATP que conduciría a una inhibición competitiva  del enzima, pero también apuntan que IND6 puede regular la actividad de AMPK mediante la unión a un bolsillo adicional.
En cuanto a TB, he estudiado la hemoglobina  truncada N (trHbN) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). El objetivo ha sido obtener un nuevo enfoque terapéutico mediante la identificación  de la base molecular de la resistencia  al estrés nitrosativo  de Mtb. Nuestra hipótesis es que una disminución  de la resistencia  al óxido nítrico  (NO)  debería  afectar  la  supervivencia   del  bacilo,  aumentando   la  eficacia  de  los  tratamientos terapéuticos actuales. La desintoxicación  del óxido nítrico (NOD, de sus siglas en inglés) se realiza mediante trHbN, que transforma NO en el inocuo anión nitrato, convirtiéndose en un mecanismo de defensa esencial de Mtb. Sin embargo, dos puntos impiden el uso de este sistema como diana terapéutica. Por un lado, la trHbN no puede ver modificada su acción mediante ningún fármaco ya que carece de bolsillos que permitan enlazar el  fármaco,  y  segundo,  porque  sería  muy  difícil  intentar  modificar  únicamente  esta  hemoglobina  en  el paciente sin provocar efectos secundarios. Por otro lado, aún se desconoce la proteína reductasa que ayuda a
 
restaurar  el estado  ferroso  de  trHbN  requerido  para  iniciar  el NOD.  Mi  objetivo  ha  sido  identificar  esta reductasa. Por esta razón, los estudios se han centrado en la identificación de tres posibles candidatos capaces de permitir la actividad NOD de Mtb. Una vez identificados, se han construido modelos 3D para cada uno de ellos  y realizado  el acoplamiento  proteína-proteína  para  obtener  un complejo  reductasa-trHbN  de partida. Durante esta investigación, varios trabajos experimentales apuntaron la importancia de uno de los candidatos identificados, la reductasa ndh. Este hecho nos permitió centrar nuestra atención en el complejo trHbN-ndh y establecer los pasos que podrían ayudar a avanzar en la definición  de una nueva estrategia terapéutica  para TB.

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Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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Exploring molecular mechanisms of key targets in metabolic and infectious diseases