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Prevalencia de "Pneumocystis jirovecii" con mutaciones asociadas a resistencia a las sulfamidas en pacientes con infección por VIH-1. Estudio de los factores de riesgo y valor pronóstico en la neumonía por "Pneumocystis jirovecii" (PCP)

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Universitat de Barcelona. Departament d'Anatomia i Embriologia Humana

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[spa] OBJETIVO GENERAL:

Desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular de Pneumocystis jirovecii, y conocimiento de la prevalencia de la resistencia a sulfamidas. 

OBJETIVOS DETALLADOS: 

1. Desarrollar técnicas de diagnóstico molecular de P. jirovecii y de tipado del gen de la Dihidropteroato Sintetasa (DHPS) de P. jirovecii, sitio activo de las sulfamidas.

2. Determinar la prevalencia de P. jirovecii con mutaciones en el gen de la DHPS, en pacientes VIH-positivos con neumonía por Pneumocystis (PcP) en España, en el periodo de la terapia antirretroviral combinada (c-ART).
  2.1. Estudiar la asociación entre las mutaciones y la exposición previa a sulfamidas y sulfonas. 
  2.2.  Estudiar los factores pronóstico de mortalidad en la PcP, y el impacto clínico de presencia de mutaciones en la  DHPS.

3. Determinar la prevalencia  de P. jirovecii con mutaciones en el gen de la DHPS, en pacientes VIH- positivos con neumonía por Pneumocystis (PcP) en Hospital Clínic de Barcelona,  en el periodo previo a la terapia antirretroviral combinada (pre c-ART), 1989-1995, y compararla con la del periodo c-ART, 2001-2004, en el mismo centro.

4. Conocer la epidemiología de la PcP,  y la prevalencia de las mutaciones en el gen de la DHPS de P. jirovecii, en  África (Sudáfrica y Malawi) y Sudamérica (Brasil). 

CONCLUSIONES:

1. Se desarrollaron dos técnicas de PCR, una nested-PCR y una PCR cuantitativa a tiempo real, para el diagnóstico de Pneumocystis jirovecii, mediante la detección del gen de la DHPS. Dichas técnicas presentaron una sensibilidad que osciló entre el 62.5% y el 100%, dependiendo del tipo de muestra clínica, y su método de conservación. 

2. En un subgrupo de 71 muestras positivas para P. jirovecii, confirmadas microscópicamente, y 70 muestras negativas, los valores de sensibilidad y especificidad fueron de 94% y 81% para la nested-PCR, y de 94% y 96% para la rT-PCR.

3. La rT-PCR cuantitativa, con un límite de detección de 1 copia de DHPS / µl de muestra,  presentó una especificidad significativa- mente mejor, que la nested-PCR. Por lo tanto, podría considerarse la técnica recomendada para el diagnóstico de P. jirovecii. 

4. La prevalencia de mutaciones en el gen de la DHPS de P.jirovecii en España, en la era c-ART, fue del 3.7%, siendo la prevalencia más baja descrita hasta el momento en EUA y Europa. 

5. Aproximadamente el 50% de los pacientes de nuestra serie de la era c-ART presentó una PcP, como debut de la infección por VIH. Por lo tanto, no habían estado previamente expuestos a profilaxis con sulfamidas. Este hecho explicaría la baja prevalencia de mutaciones en el periodo c-ART en nuestro país.

6. La mortalidad global de la serie de pacientes en la era c-ART fue de15%, elevándose a 80% en los pacientes que requirieron ventilación mecánica.

7. Ninguno de los pacientes que presentó mutaciones en el gen de DHPS requirió ingreso en UCI, ni murió. Por lo tanto, podemos concluir que su presencia no se asocia a un peor pronóstico en la PcP. 

8. Las mutaciones en el gen de DHPS sólo confieren un bajo nivel de resistencia a las dosis de sulfamidas administradas como profilaxis, pero a mayores dosis de sulfamidas, administradas con fines terapéuticos, el tratamiento con TMP-SMX fue efectivo en la mayoría de los casos.

9. Presentar una Pao2 < 60 mmHg al ingreso se identificó como un factor de riesgo de ingreso en UCI, mientras que haber tomado c-ART previamente, se mostró como un factor protector.

10. Presentar una Pao2 < 60 mmHg al ingreso, o la necesidad de ingreso en UCI durante la 1º  semana de hospitalización, se asociaron a una mayor mortalidad. La severidad de la insuficiencia respiratoria al ingreso determinó el pronóstico de la PcP.

11. Las mutaciones en el gen de la DHPS fueron más frecuentes en el periodo pre-cART (1989-1995), que en el periodo c-ART (2001-2004), siendo del 33% vs 5.5%, respectivamente. La exposición previa a las sulfamidas en los pacientes en el periodo pre-cART fue del 51% frente al 20% en el periodo c-ART,  lo que explicaría la mayor prevalencia de mutaciones. Sin embargo, su presencia tampoco empeoró el pronóstico dela PcP.

12. Las mutaciones en DHPS de P. jirovecii fueron infrecuentes en niños sudafricanos infectados por VIH (prevalencia de 13.3%),  siendo probablemente debido a una transmisión madre-hijo de cepas mutantes, más que a una sobre-exposición a sulfamidas. Aunque la mortalidad por PcP fue elevada en Sudáfrica (66.7%), no se incrementó por la presencia de mutaciones.

13. La incidencia de PcP en adultos infectados por VIH en Malawi fue de 1.0/100 personas/a, siendo menor que la incidencia de la tuberculosis pulmonar y de la neumonía bacteriana.14.No se detectaron mutaciones en la serie de 70 pacientes infectados con VIH y PcP en Brasil, por una menor exposición a sulfamidas.

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[eng] MAIN OBJECTIVE:

Development of diagnostic molecular techniques of Pneumocystis jirovecii, and determine the prevalence of resistance to sulfa-drugs in Spain, and study of the PcP epidemiology in South Africa, Malawi and Brazil.

RESULTS AND CONCLUSIONS:

1. Two PCR techniques were designed, a nested PCR and a quantitative real-time PCR (rT-PCR) to detect DHPS of P. jirovecii. Sensibility of both ranges between 62.5% and 100%, depend on type of sample.
2. Nested-PCR and rT-PCR showed a sensibility of 94%, and specificity of 96% and 81%, respectively. rT-PCR could be considered as molecular standard diagnostic technique of P. jirovecii.
3. Prevalence of sulfa-drugs resistance in Spain in the combined antiretroviral therapy (c-ART) era was 3.7%. The lowest described in US and Europe, maybe due to PcP was the debut of HIV infection in almost 50% of patients, so they were not exposed previously to sulfa-drugs. 
4. Global mortality of patients in the c-ART era was 15%, going to 80% in patients who required mechanical ventilation. Patients harbouring DHPS mutations did not require mechanical ventilation, neither ICU admissions. None of them died. Treatment with cotrimoxazole was effective in almost every patient.
5. To show a Pao2 < 60 mmHg at admission was identified as a risk factor of ICU admission, and to have c-ART previously a protector factor.
To show a Pao2 < 60 mmHg at admission and need ICU admission at first week were identified as a risk factor of mortality.
6. Prevalence of DHPS mutations in pre c-ART period was 33%, when previous sulfa-exposure was higher, although, their presence did not worse the outcome.
7. The prevalence of DHPS mutations in HIV South African children was 13.3%, probably due to a mother-to -child transmission of mutant strains; their presence did not increase the mortality.
8. The incidence of PcP in HIV-infected adults in Malawi was 1.0/100 persons/year, lower than tuberculosis and bacterial pneumonia.
9. DHPS mutations were not detected in the HIV-infected Brazilian patients with PcP, maybe due to a lowest sulfa-drug exposure.

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Tesis Doctorals - Departament - Anatomia i Embriologia Humana

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Prevalencia de "Pneumocystis jirovecii" con mutaciones asociadas a resistencia a las sulfamidas en pacientes con infección por VIH-1. Estudio de los factores de riesgo y valor pronóstico en la neumonía por "Pneumocystis jirovecii" (PCP)

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Prevalence of DHPS mutations of Pneumocystis jirovecii in HIV-infected patients. Study of risk factors and outcome in Pneumocystis pneumonia (PcP)