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Regulation of E2F1 Transcription Factor by Glycogen Synthase Kinase-3-Beta

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió IV)

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[eng] Whether a cell enters the cell cycle, undergoes apoptosis or survives is a consequence of the integration of several cellular and environmental signals. Growth factors, cell contact, and apoptotic inductors regulate a complex system of signal transduction pathways that trigger the activation of a large number of genes. One of the key proteins in the regulation of the cell cycle and the commitment to apoptosis is the transcription factor E2F1. It has been suggested that E2F1 activity levels could determine whether a cell enters the cell cycle, cell-cycle arrest or apoptosis. In these decisions, not only is transcriptional activity important, but also the synchronization of E2F1 activity with specific signal transduction pathways. In this context it has been suggested that activation of the PI 3-kinase pathway inhibits the apoptotic effect of E2F1 overexpression. Since GSK3-beta is a downstream effector of PI 3-kinase, we performed phosphorylation and binding analyses to examine the possible relationship between GSK3-beta and E2F1. The results obtained in this thesis demonstrate that GSK3-beta phosphorylates human E2F1  in vitro  at serine 403 and threonine 433. In earlier studies it has already been shown that these two residues are also phosphorylated by the TFIIH kinase, cdk7. We did not detect phosphorylation by GSK3-beta  in vivo . However, immunoprecipitation experiments revealed  in vivo  binding of these proteins. By transient transfection experiments with GSK3-beta and E2F1 constructs, GSK3-beta -RNAi assays, and the use of PI 3-kinase and GSK3-beta specific inhibitors, we demonstrate that GSK3-beta regulates E2F1 transcriptional activity through its interaction with E2F1 transactivation domain and that GSK3-beta kinase activity is not required for this regulation.  Our data obtained here integrates into a model in which translocation of GSK3-beta to the nucleus modulates E2F1 activity and, as a consequence, determines whether a cell enters the cell cycle or undergoes apoptosis.

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[spa] La decisión de una célula de iniciar el ciclo celular, ir hacia apoptosis o sobrevivir es consecuencia de la integración de diferentes señales extracelulares. Los factores de crecimiento, los contactos entre células, así como diversos inductores de apoptosis regulan un complejo sistema de vías de transducción de señales que inducen la activación de un gran número de genes implicados en la respuesta celular de los procesos mencionados anteriormente. Una de las proteínas claves en la regulación del ciclo celular y/o de la entrada en apoptosis es el factor de transcripción E2F1. Se ha sugerido que los niveles de actividad E2F1 pudieran actuar como sensores de la entrada o parada del ciclo celular y apoptosis. En estas decisiones no sólo la actividad transcripcional es importante sino también la sincronización de E2F1 con vías de transducción específicas. Es en este contexto en el cual se ha sugerido que la activación de la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI 3-quinasa) inhibe el efecto apoptótico causado por la sobreexpresión de E2F1. Debido a que la glicógeno sintasa quinasa-3-beta (GSK3-beta) es uno de los substratos fisiológicos más importantes de esta vía, se realizaron experimentos con el fin de analizar la existencia de una interacción entre estas dos proteínas.  Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que GSK3-beta fosforila al factor de transcripción E2F1 humano  in vitro  en las posiciones serina 403 y treonina 433. Estos residuos ya han sido descritos anteriormente como substratos de la fosforilación por parte del complejo quinasa TFIIH, concretamente por uno de sus miembros: cdk7. A pesar de que no podemos detectar fosforilación  in vivo , experimentos de immunoprecipitación confirman la existencia de una unión in vivo entre las proteínas GSK3-beta y E2F1. Mediante transfecciones transitorias, 'RNA interference (RNAi)', y la utilización de inhibidores específicos de PI 3-quinasa y GSK3-beta demostramos que GSK3-beta regula la actividad de E2F1 a través de la interacción con su dominio transactivador y que la actividad quinasa de GSK3-beta no es requerida para esta activación.  Por tanto, nuestros resultados se integrarían en un modelo en el que la translocación de GSK3-beta al núcleo modularía la actividad E2F1 y, en consecuencia, la decisión de una célula de entrar en el ciclo celular o dirigirse hacia la apoptosis.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Divisió IV)

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Regulation of E2F1 Transcription Factor by Glycogen Synthase Kinase-3-Beta