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Mejora de la eficiencia metastásica en un modelo de cáncer colorrectal humano y efecto del oncogén K-RAS en la transición de micro a macrometástasis

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Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia

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[spa] Los modelos de cáncer colorrectal (CCR) generados mediante inyección ortotópica de líneas celulares de CCR humano, cultivadas extensamente in vitro, tienen escasa eficiencia metastásica. Únicamente un porcentaje bajo de las líneas inyectadas generan metástasis, mientras que aquellas que generan metástasis, reproduciendo el patrón de diseminación linfática, hematológica y transcelómica observado en clínica, las generan de un tamaño  microscópico, de modo que, a diferencia de lo que ocurre en pacientes, los animales mueren por crecimiento del tumor primario, y no por la diseminación metastásica. 
En esta tesis, nos propusimos el desarrollo y la evaluación de dos nuevas estrategias para aumentar la eficiencia metastásica en los modelos de CCR. El primer abordaje consistió en la movilización de células madre de la médula ósea, para promover la formación del nicho premetastásico, previamente a la inyección ortotópica de la línea de CCR HCT116, y aumentar la capacidad de diseminación. No obstante, esta aproximación obtuvo un efecto contrario al esperado. Observamos una disminución del volumen tumoral, así como de la diseminación metastásica linfática y hematógena. 

La segunda estrategia que utilizamos fue la implantación subcutánea de líneas celulares de  CCR, previa  inyección ortotópica, en base al aumento de la diseminación tumoral mediante pases sucesivos in vivo, descrita previamente por otros autores y confirmada en nuestro laboratorio. Para desarrollar este objetivo, utilizamos la línea celular de CCR HCT116, de la que conocemos su capacidad metastásica. Esta línea genera un número significativo de micrometástasis a nivel linfático, hepático y pulmonar, y únicamente un pequeño número de macrometástasis circunscritas a ganglios linfáticos mesentéricos y a la cavidad peritoneal. El condicionamiento subcutáneo previo a la inyección ortotópica (SC+ORT) supuso una mejora en la eficiencia metastásica, respecto a la microinyección ortotópica directa (ORT), aumentando tanto el número de animales afectados por metástasis como el número y tamaño de los focos metastásicos en ganglios linfáticos, hígado y pulmón. Y, especialmente, un desarrollo de  metástasis hepáticas visibles en el grupo SC+ORT que invadían el 90-95% del parénquima hepático mejorando considerablemente los modelos de metástasis actuales ya que son las metástasis hepáticas las que comprometen la vida de los pacientes. La mejora de la eficiencia metastásica en el grupo SC+ORT se asocia, a nivel molecular, con un aumento de VEGF-A,  activación de AKT  e infrarregulación de la integrina beta-1.

Una vez validado el modelo, se estudió el papel de las mutaciones del oncogen K-RAS  más frecuentes en cáncer, en metastagénesis,  utilizando la línea celular de CCR SW48 que expresaba el mutante de K-RAS Valina 12 (K12V) o el mutante con aspártico 13 (K13D). Esta estrategia se basó en resultados previos de nuestro grupo que demostró distinta capacidad tumorigénica de los diferentes mutantes del oncogén K-ras, asociada a una activación diferencial de vías distales a K-RAS en sarcomas. La expresión de los oncogenes K12V o K13D aumentó el tamaño de los tumores generados y disminuyó la supervivencia de los animales respecto al grupo control (SW48 parental, K-ras WT). En los tres grupos comparados, se aplicó el condicionamiento subcutáneo previo a la microinyección ortotópica para aumentar la escasa tasa de metastásis por inyección ortotópica directa de la línea SW48. Únicamente, K12V aumentó significativamente la tasa de injerto tumoral respecto al grupo WT, pero ambos oncogenes aumentaron la tasa de metástasis. Como se esperaba, cada oncogén se asoció con efectos distintos sobre las metástasis.  K12V generó metástasis linfáticas en un número mayor de animales, generando, a su vez, metástasis microscópicas y visibles de mayor tamaño que K13D. En cambio, la expresión de K13D generó micrometástasis pulmonares de mayor tamaño que K12. La diferente eficiencia metastásica de los mutantes del oncogén  K12V y K13D en los distintos órganos, se asoció con un patrón de expresión molecular distinto. Mientras K12V presenta mayor activación de la vía de AKT y mayor expresión de integrina beta-5 y VEGF-A, K13D mostró mayor expresión de integrina beta-1 y angiopoyetina-2. El condicionamiento subcutáneo previo de líneas celulares de CCR humano permitirá aumentar la eficacia metastásica de los modelos actuales, facilitando el estudio de los mecanismos implicados en metastagénesis. Por otra parte, el conocimiento de las alteraciones moleculares asociadas con la distinta capacidad metastásica y agresividad de los distintos oncogenes K-RAS facilitará el estudio de los mecanismos asociados con la agresividad de los tumores portadores de mutaciones específicas en este oncogén y  posteriores estudios  dirigidos a determinar su capacidad pronóstica en CCR humano.

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[eng] Colorectal cancer (CRC) models generated by orthotopic injection of human CRC lines, which have grown extensively in vitro, display a low metastatic efficiency. Thus, most cell lines do not metastasize; and, those that generate metastatic foci achieve only a microscopic size, despite of reproducing the pattern of lymphatic, hematological and transcoelomic spread observed in patients. Consequently, unlike what happens in patients, animals die because of primary tumor growth rather than metastatic growth.
In this dissertation, we proposed the development and evaluation of two new strategies to increase the metastatic efficiency of CRC models. The first approach involved the mobilization of stem cells from bone marrow in an attempt to promote the premetastasic niche formation, prior to the HTC116 CRC cell line orthotopic microinjection, in an attempt to enhance metastasis formation. However, this approach achieved the opposite effect to the expected one.
As a second strategy, we used the subcutaneous implantation of the HCT116 cell line prior to their orthotopic microinjection, on the basis of previous reports, which we have confirmed in our laboratory, of an increase in tumor dissemination through successive in vivo passages. The subcutaneous passage prior to its orthotopic injection (SC+ORT) significantly enhanced the metastatic efficiency, as compared to its direct orthotopic microinjection (ORT). This procedure increased the number of affected animals as well as the number and size of metastatic foci in lymph nodes, liver and lung, and was associated with the activation of the VEGFA and AKT pathways, and the downregulation of integrin β1.  This approach especially improved hepatic dissemination, since tumor foci in the liver grew to achieve a visible metastasis size that invaded 90-95% of the hepatic parenchyma leading to animal death. This is a significant improvement of current metastatic models, since it reproduces not only the dissemination from the primary tumor to the liver, but also the compromise of the patient's life by the growth of the hepatic metastases.
Once we validated, we applied this procedure to study the role of different point mutants of the K-ras oncogene in metastagenesis, using the SW48 CRC cell line which was engineered to express the K-rasG12V (K12V) or K-rasG13D (K13D) oncogenes. The subcutaneous passage prior to the orthotopic microinjection of SW48 recombinants enhanced metastatic efficiency of current models, therefore, facilitating the study of the mechanisms associated with metastatic dissemination by oncogene expression. In particular, the enhanced metastatic capacity of the K12V oncogene, as compared to K13D, is associated with the activation of the integrin β5, serpine-1, VEGFA, CXCR4 in tumour emboli and AKT pathway.  Consequently, knowledge on the molecular alterations associated with the different metastatic ability of the CRC tumors, expressing different K-ras oncogenes, will facilitate the study of the mechanisms underlying their aggressiveness and will also facilitate a more accurate assessment of their prognostic capacity in human CRC.

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Mejora de la eficiencia metastásica en un modelo de cáncer colorrectal humano y efecto del oncogén K-RAS en la transición de micro a macrometástasis