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Estudio funcional de la proteína desacopladora mitocondrial UCP3 en relación con la apoptosis y las especies reactivas de oxígeno

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

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[spa] El presente trabajo de tesis doctoral se ha centrado en la determinación de la función fisiológica de la proteína desacopladora mitocondrial UCP3 en relación con la apoptosis y las especies reactivas de oxígeno (ROS). UCP3 es un miembro de la familia de transportadores mitocondriales que se expresa preferencialmente en el músculo esquelético. UCP3 es una proteína homóloga a la termogenina o proteína desacopladota UCP1. Ésta se expresa exclusivamente en tejido adiposo marrón dónde desempeña una función esencial en la termogénesis adaptativa, desacoplando la respiración mitocondrial de la fosforilación oxidativa con la consiguiente generación de calor. Así, como homólogo de la termogenina UCP3 podría desarrollar una actividad desacoplante mitocondrial influenciando el metabolismo energético celular, sin embargo su función biológica exacta continúa siendo fruto de controversia. En un primer trabajo, demostramos como la expresión ectópica de UCP3 en células de riñón humanas (293 HEK) mediante un sistema de expresión inducible sensible a tetraciclina, es consistente con un papel desacoplante mitocondrial de la proteína en la mitocondria de estas células. Observamos que la expresión de UCP3 no induce apoptosis directamente pero incrementa la sensibilidad a un agente inductor de apoptosis dependiente de vías de activación mitocondriales como es la staurosporina. Además, la inducción de UCP3 amuenta la sensibilidad del MPTP (mitochondrial transition pore) al calcio, facilitando la apertura del poro lo que se considera un evento crucial en la apoptosis dependiente de regulación mitocondrial. Estos datos sugieren una función de UCP3 en la regulación de la actividad del MPTP y sugieren que la presencia de UCP3 en la mitocondria sensibiliza a las células a los estímulos pro-apoptóticos que dependen de vías mitocondriales. Tras la obtención de los mencionados resultados, procedimos a inducir la expresión ectópica de UCP3 in vivo utilizando vectores adenovíricos dirigidos al hígado de ratón. El hígado normal no expresa ninguna proteína desacoplante y constituye por tanto un entorno ideal para determinar la función de UCP3. Resultados preliminares sugieren que la expresión ectópica de UCP3 no altera significativamente a parámetros metabólicos como la producción de ROS, aunque hallamos una estimulación de la apertura del MPTP en respuesta al calcio. Estos resultados procedentes de los estudios in vivo corroboran nuestros resultados previos obtenidos en líneas celulares en cultivo. Se cree que las proteínas desacoplantes podrían controlar la producción de ROS gracias a su capacidad para promover un desacoplamiento suave en la membrana mitocondrial interna. Hemos estudiado la función de UCP3 en su entorno natural de expresión, la célula del músculo esquelético, concretamente en lo que hace referencia a la muerte celular programada o apoptosis y las especies reactivas de oxígeno. Se demuestra que la expresión e UCP3 en miotubos no disminuye la producción de ROS, sino que incluso se incrementa en respuesta a un agente inductor de ROS como es la staurosporina. Igualmente, encontramos una sobreestimulación de la producción de ROS en respuesta a elevadas concentraciones de ácidos grasos, una situación en la que se estimula la expresión y actividad de las proteínas desacoplantes. Las ceramidas son productos secundarios del acúmulo de ácidos grasos capaces de inhibir la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial. Los desacoplantes químicos pueden incrementar la producción de ROS en aquéllas situaciones en que la cadena respiratoria se encuentra inhibida. Pensamos que la sobre-inducción de ROS que observamos en presencia de UCP3 se deba a la acción conjunta de la proteína las ceramidas sobre la actividad respiratoria. Concluimos que UCP3 se comporta en los miotubos de forma compatible con una actividad desacoplante, promoviendo una sensibilización a la producción de ROS en respuesta a ciertos estímulos de estrés, como pueden ser un agente pro-apoptótico o elevadas concentraciones de ácidos grasos. Además, UCP3 promueve una sensibilización de la célula a la muerte programada inducida por estímulos dependientes de regulación mitocondrial. El análisis de la función de UCP3 en su entorno natural de expresión, el músculo esquelético, supuso además una profunda caracterización del comportamiento de la célula muscular ante los estímulos pro-apoptóticos.

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[eng] My work of thesis has been focused on determining the role of mitochondrial uncoupling protein 3 (UCP3) in relation to apoptosis and reactive oxygen species (ROS). The mitochondrial uncoupling protein-3 is a member of the mitochondrial carrier protein family that is preferentially expressed in skeletal muscle. As a homologue of the thermogenic brown fat uncoupling protein-1, it possesses a mitochondrial uncoupling activity and thus can influence cell energy metabolism but its exact biological function remains unclear. We have previously proved that the induced expression of uncoupling protein-3 in the mitochondria of 293 cells using a tetracycline-inducible system was in agreement with its expected physiological behavior as an uncoupling protein (UCP). We observed that Uncoupling protein-3 expression did not cause apoptosis per se but increased the responsiveness of the cells to a mitochondrial apoptotic stimulus such as staurosporine, an apoptosis-inducer dependant on mitochondrial pathways. Moreover, the induction of uncoupling protein-3 increased the sensitivity of mitochondria to open the permeability transition pore (MPTP) in response to calcium, a well-known inducer of its opening which is a critical event in mitochondrial-driven apoptosis. This suggested for first time a role for UCP3 in cthe regulation of this channel activity. We could conclude that the presence of uncoupling protein-3 in mitochondria sensitizes cells to apoptotic stimuli involving mitochondrial pathways. Then, we induced in vivo ectopic expression of UCP3 in the liver of mice, using an adenoviral vector. Although preliminary, our results suggest that ectopic UCP3 expression is not significantly affecting to metabolic parameters or ROS production, but it is, as it happened in 293 cells, enhancing sensitivity of MPTP to its opening, corroborating our previous results. We are now characterizing the biochemical behaviour of UCP3 in the liver to finish a manuscript compelling all these results. Uncoupling proteins are thought to control ROS production due to their capacity to promote a mild uncoupling of the inner mitochondrial membrane. We have been studying UCP3 function in its natural environment of expression, the skeletal muscle cell. We have proved that UCP3 expression in myotubes does not decrease ROS production even in response to ROS-inducing agents such as staurosporine. In fact, it promotes enhanced ROS production in response to high fatty acid concentration. Ceramides are secondary products of fatty acid accumulation and can inhibit respiratory chain activity. Chemical uncouplers are known to increase ROS production in situations in which respiratory chain is inhibited. We are therefore currently exploring the possibility that ROS over-production could be due to the overlapping action of ceramides and UCP3. As a whole, we have demonstrated an involvement of UCP3 in apoptosis regulation and in the modulation of ROS production besides of performing a deep characterization of apoptosis responsiveness within skeletal muscle cell.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

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Estudio funcional de la proteína desacopladora mitocondrial UCP3 en relación con la apoptosis y las especies reactivas de oxígeno