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Modulación "in vivo" e "in vitro" de los sistemas de transporte hepáticos de alanina

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

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[spa] En este trabajo se han realizado estudios sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, intentando correlacionar las alteraciones observadas en la captación hepática de aminoácidos "in vivo" con cambios estables en las propiedades cinéticas de los sistemas de transporte estudiadas "in vitro". Se han estudiado tres situaciones experimentales diferentes: ayuno, gestación y lactancia. Posteriormente se han realizado estudios sobre el posible efecto a corto plazo de diversas hormonas (Glucagón, Insulina y Factor de Crecimiento Epidermal "EGF") sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata. En los resultados expuestos en esta memoria sobre la modulación "in vivo" e "in vitro" de la captación de L-alanina por vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, se han observado los siguientes puntos: 1. - En la rata, la privación de alimento produce un aumento de la afinidad (Km) y un descenso de la capacidad (Vmax) de los sistemas de transporte de L-alanina. Estos cambios en los parámetros cinéticos están altamente correlacionados con un descenso gradual en la asequibilidad portal de alanina. 2. - Durante el ayuno, se producen cambios importantes en la inhibición de la función transportadora por otros aminoácidos naturales. La estrategia utilizada para discernir entre la proporción relativa de los sistemas de transporte en la captación de L-alanina, mediante pruebas con MeAIB y Litio, revelan que estos cambios no parecen ser atribuibles a una modificación en la participación de los sistemas A y ASC en el transporte total de alanina. 3. - La fuerte correlación existente entre los cambios de Km y las K(1/2) del efecto inhibidor sobre el transporte de agentes modificadores de grupos -SH, como el NEM o el PCMBS, revelan cambios conformacionales en la(s) molécula(s) transportadora(s). Esta posibilidad es compatible con la presencia de grupos -SH en el centro activo de la proteína o, alternativamente, en dominios muy directamente implicados con la función transportadora. 4. - En la gestación y la lactancia, situaciones fisiológicas caracterizadas por un aumento en la captación hepática de aminoácidos "in vivo", se comprueba que los índices de captación de L-a1anina calculados a partir de las medidas de transporte en preparaciones de vesículas de membrana plasmática de hígado, están incrementados en el rango de concentraciones fisiológicas de substrato. No obstante, las adaptaciones realizadas mediante cambios en los parámetros cinéticos en ambas situaciones fisiológicas son diferentes; mientras que en la gestación se detecta un incremento de Vmax, durante la lactancia se observa un descenso de Km, que creemos atribuible a un cambio en la participación relativa de los sistemas A y ASC en el transporte total de este aminoácido a nivel hepático. 5. - El glucagón y el factor de crecimiento epidermal (EGF) ejercen acciones inhibidoras, a muy corto plazo, sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata. Su acción parece ser específica sobre aquellos transportadores que utilizan al ión sodio como co-substrato del aminoácido, puesto que no se detecta ningún efecto al estudiarse el transporte de L-leucina. El efecto inhibidor de estos péptidos parece realizarse acelerando la disipación del gradiente de sodio a través del "antiporter" Na(+)-H(+), ya que dicho efecto se revierte al ser estudiado en presencia de HMA, un derivado de la amilorida que actúa como inhibidor específico del "antiporter". 6. - Dado que en las preparaciones vesiculares utilizadas no existe actividad Na-K ATPasa funcional, podemos concluir que los efectos hormonales observados en nuestras vesículas de membrana plasmática son compatibles con la hipótesis que sugiere que los efectos estimuladores de glucagón y EGF sobre el transporte dependiente de sodio de aminoácidos a nivel hepático, se realizarían mediante la hiperpolarización de la membrana. Debido a los anteriores resultados los factores que determinarían las tasas de captación hepática de aminoácidos "in vivo" serían producto de, al menos, las siguientes adaptaciones: En primer lugar, cambios en los parámetros cinéticos de sistemas transportadores. Estos cambios pueden implicar tanto modificaciones de capacidad total (Vmax) como de afinidad (Km). En este último caso, parece que esta adaptación pueda llevarse a cabo, tanto modificándose la proporción relativa de transporte de los sistemas implicados en la captación de L-alanina, como induciéndose, de forma todavía no conocida, la presencia de formas moleculares que, si bien obedecen a las características bioquímicas descritas para sistemas ya conocidos, actúan con una afinidad distinta hacia el substrato. Por otra parte, en los casos en que se detectan cambios de afinidad hacia el substrato, es esperable y así se comprueba que existan modificaciones en la eficacia inhibidora del transporte dependiente de sodio de L-alanina por parte de otros aminoácidos naturales. Si a este hecho le añadimos la evidencia de que en cada situación fisiológica el patrón de concentraciones de aminoácidos en la vena porta varía, es fácil imaginar que ambos factores, cambio de concentración y de eficacia inhibidora, jugarán un papel importante a la hora de determinar la captación neta "in vivo". Finalmente el contexto hormonal existente en la vena porta juega un papel decisivo en la modulación de la captación neta de aminoácidos "in vivo". Obviamente, este factor no está presente en las preparaciones vesiculares y debe considerarse a la hora de determinar hasta que punto los cambios observados, en los balances hepáticos de aminoácidos "in vivo", pueden ser explicados por modificaciones estables de la cinética de los sistemas responsables de su transporte.

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[eng] It has been studied the alanine transport in plasma membrane vesicles from rat livers. The studies have been focused on to correlate the changes in hepatic amino acid metabolism "in vivo" with the changes in kinetic values "in vitro". It has been chosen three experimental models: food deprivation, pregnancy and 1actation. Starvation induced a decrease in Km (2.32, 1.60, 1.10 mM) and Vmax (1.86, 1.69, 1.10 pmol Ala/l0s per microgr. protein) for control, fasted 24h and 48h respectively. The Km va1ues have a good relation with the decrease in hepatic availability and with a decrease in the K(l/2) values from sensitivity to sulfhydryl specific reagents such as NEM and PCMBS. Studies with Li and MeAIB show that the proportion of A and ASC systems not change during starvation. This results suggest that it can exist changes in conformational status of transport proteins. In the studies with late pregnant rats, it has been found a light increase in Vmax values (1.7 vs 2.0 pmol Ala/l0s per microg. protein) without changes in Km (2.3 vs 1.8 mM) for virgin and pregnant rats respective1y. The alanine utilization rates, as calculated from plasma membrane enzyme marker recoveries, were enhanced in the physiological range of alanine concentration in blood. Kinetic parameters of alanine transport were measured in plasma membrane vesicles from livers of 15 days lactating rats. Lactation induced 10w Vmax and Km va1ues of the sodium dependent alanine component of transport (1.8 vs 1.3 pmol A1a/10s per microgr. protein and 2.3 vs 1.2 mM, respectively). At the same way than late pregnant rats the alanine utilization rates were enhanced. The decrease of Km values seen to be atributable to a greater contribution of system A to the total Na+-dependent alanine transport as deduced from less tolerance to lithium substitution instead Na, a greater inhibition of alanine transport by saturating amounts of MeAIB y proline, and higher sensitivity to NEM and PCMBS. Finally, it has been studied the hormonal short-term effects of glucagon and EGF on sodium dependent alanine transport in plasma membrane vesicles from rat liver. The resu1ts suggest that the hormone action on Na+ dependent amino acid transport is modifying the sodium electrochemical flux through the Na+-H+ antiporter. This hipothesis is based from studies on selective inhibition of antiporter activity.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

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Modulación "in vivo" e "in vitro" de los sistemas de transporte hepáticos de alanina