# name
Models in vivo i in vitro per a l'estudi de gens causants de distròfies de retina: CERKL i RP2.

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Departament de Genètica

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] Les distròfies de retina (DR) engloben un conjunt de patologies caracteritzades per la degeneració dels fotoreceptors i les cèl·lules de l’epiteli pigmentari de la retina, i representen la major causa de ceguesa hereditària. Són malalties altament heterogènies clínica i genèticament. La retinosi pigmentària (RP) és la DR més freqüent, amb una prevalença d'1:4000 i més d'un milió d'afectats arreu del món. Fins l'actualitat, s'han descrit gairebé 200 gens i loci responsables de DR, però s'estima que aquests expliquen poc més de la meitat dels casos. En els últims anys, s'han centrat molts esforços en la cerca de nous gens i mutacions, fonamental per tal d’oferir als pacients i als seus familiars un diagnòstic genètic acurat i, en alguns casos, una bona prognosi de la malaltia. No obstant, una vegada identificada la causa molecular, l'estudi funcional no es presenta com una tasca trivial. Si bé l'estadi final de les DR és comú en la majoria dels casos, -la mort per apoptosi dels fotoreceptors-, els diferents gens DR participen en una gran diversitat de vies i aspectes cel·lulars dels fotoreceptors. En aquest context, és molt important combinar estratègies in silico, in vitro i in vivo per abordar-ne l'estudi acurat. El treball d'aquesta tesi doctoral s'ha basat en l'obtenció de models in vivo i in vitro per a l'estudi de dos gens causants de distròfies de retina, CERKL i RP2. El primer, va ser descrit pel nostre grup l'any 2004 com a causant de RP d’herència autosòmica recessiva. Malgrat les primers anàlisis de predicció varen revelar una elevada homologia amb la quinasa de ceramides (CERK), diversos estudis han fracassat a l'hora de validar l'activitat fosforilativa de CERKL. A l'inici d'aquesta tesi, CERKL es presentava com una proteïna òrfena de funció. Per aquesta raó, varem iniciar-ne l'aproximació funcional, basada primerament en l'estudi transcripcional en detall del gen a la retina. Els resultats varen mostrar una gran complexitat transcripcional, deguda principalment a l'splicing alternatiu i a l'ús de promotors alternatius. A més, es varen identificar promotors específics de teixit, fet que posava de manifest l’elevada regulació en l’expressió d’aquest gen. Pel que fa a la localització cel·lular de la proteïna, CERKL presenta un clar dinamisme cel·lular entre els compartiments citoplasmàtic i nuclear, amb una localització depenent de tipus cel·lular a la retina murina. Tot plegat, suggeria un paper multifuncional de CERKL. Per abordar la seva contribució a la degeneració retinal, es varen generar dos models animals. D’una banda, un ratolí knockout Cerkl-/- i, de l’altra, un model knockdown en peix zebra. L’estudi acurat del fenotip ens va revelar una disfunció a nivell ganglionar i/o amacrí en el cas del model murí, acompanyada d’un augment de l’estrès i mort cel·lular en la retina. D’altra banda, en el cas del model en peix zebra, els animals presentaven ulls de mida reduïda, juntament amb defectes en la laminació de la retina i en la formació dels segments externs dels fotoreceptors. Segons els nostres resultats, Cerkl no sembla contribuir en el desenvolupament primerenc de la retina d’aquest teleosti, si bé podria participar en processos de degeneració secundaris. En ambdós models es va posar de manifest la contribució de CERKL en les vies d’estrès i apoptosi cel·lular. En el futur, quan les teràpies gèniques estiguin ben establertes i els pacients puguin accedir a elles, serà fonamental el coneixement de les bases genètiques de la malaltia i l’impacte molecular de les mutacions descrites en cada cas. En aquest context, s’han realitzat estudis tant in vitro com in vivo de dues mutacions identificades als gens CERKL i RP2 en famílies espanyoles. Les diferents anàlisis ens han permès comprovar l’impacte patogènic d’aquestes mutacions sobre els productes gènics, basat en la degradació o formació aberrant de les isoformes del mRNA. A més, en el cas de RP2, responsable de RP lligada al cromosoma X, hem reportat per primera vegada un cas de semi-dominància degut a mutacions en aquest gen. L’estudi de les mostres de les dones portadores de la família ens han permès demostrar un biaix en l’expressió dels al·lels de RP2, segurament donada per la inactivació no atzarosa del cromosoma X, com a causa directa del fenotip.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] Retinal dystrophies (RD), the major cause of incurable familial blindness in the Western world, are monogenic disorders characterized by progressive dysfunction of photoreceptor and retinal pigment epithelium cells. RD is a group of extremely heterogeneous diseases that show substantial clinical and genetic overlap. Highthroughput technologies have greatly improved our knowledge of the genetic basis of RD. Indeed, more than 180 RD genes have already been reported and this number is constantly increasing. However, although RD genes are known to be involved in a variety of celular and molecular processes in the retina, we are still far from understanding the contribution of most of them to the disease. In this context, we have aimed to study the contribution to the pathogenesis of two RD genes: CERKL and RP2. The first was identified by our group in 2004, as a responsible for autosomic recessive retintitis pigmentosa (RP). To shed light on the pathogenicity of the mutations in this gene, we aimed to characterize its transcriptional repertoire. Our results showed an unexpected multiplicity of CERKL transcriptional start sites plus a high variety of alternative splicing. In order to approach the function of the retinal dystrophy CERKL gene we generated a knockout mouse model. KO animals showed clear and consistent signals of gliosis and retinal stress, togheter with a non-progressive perturbation of ganglion cells. The failure to reproduce the human phenotype in the mouse, not unusual in other hereditary retinal disorders, prompted us to explore zebrafish as an alternative model. The phenotype resulted in abnormal eye development with lamination defects, failure to develop photoreceptor outer segments, increased apoptosis of retinal cells and small eyes. Our data supported that zebrafish Cerkl does not interfere with proliferation and neural differentiation during early developmental stages but is relevant for survival and protection of the retinal tissue. Finally, we have analized the pathogenicity of a new variant in RP2, a X-linked RP gene. The study of the RP2 splicing pattern in blood samples of patients and carrier females showed a aberrant mRNA transcript. High levels of variation observed for RP2-spliced products in female carriers supports X chromosome–skewed inactivation as the cause of the disease in the affected females.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Departament - Genètica

# metadata.dc.title[].value
Models in vivo i in vitro per a l'estudi de gens causants de distròfies de retina: CERKL i RP2.