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Respuesta defensiva inducida por "Perkinsus atlanticus".  Reacción celular y expresión de p225 en "Tapes" spp

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Universitat de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular

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[spa] Los protozoos pertenecientes al género "Perkinsus" son parásitos de numerosas especies de bivalvos y gasterópodos marinos. Los efectos deletéreos de esta parasitosis son dependientes de las condiciones medioambientales, habiéndose constatado que temperaturas y salinidades elevadas aumentan la prevalencia y la intensidad de la infección. El ciclo vital conocido de estos protozoos lo componen trofozoitos, hipnosporas y zoosporas, siendo los trofozoitos el estadio vegetativo que prolifera en el tejido conjuntivo del huésped. El parasitismo de "Perkinsus" induce diferentes respuestas defensivas según el huésped y la especie. Las almejas venéridas "Tapes semidecussatus" y "T. decussatus" desarrollan frente a la infección de "P. atlanticus" una reacción inflamatoria, mediada por hemocitos granulares, que causa la encapsulación de este parásito. Si bien la encapsulación es una estrategia defensiva habitual tanto en moluscos como en otros grupos de invertebrados, la desarrollada por estas almejas contra los trofozoitos de "P. atlanticus" exhibe características singulares. Así, mientras las cápsulas de moluscos suelen estar compuestas por hemocitos, células semejantes a fibroblastos y fibras del tejido conjuntivo, en estas almejas venéridas, los trofozoitos de "P. atlanticus" son encapsulados por un material de naturaleza no fibrilar secretado por los hemocitos infiltrados en la vecindad de los parásitos. El componente mayoritario de la cápsula es un polipéptido (p225) de un peso molecular aproximado de 225 kDa. Los ensayos de deglucosilación revelan que p225 no está glucosilado, dado que ni la incubación con Endo II ni la fi-eliminación alcalina mostraron un efecto detectable en su peso molecular. La imnunolocalización de este polipéptido indica que "p225" es almacenado en los gránulos de los granulocitos infiltrados, siendo secretado y organizado como una cápsula alrededor de los trofozoitos. Asimismo, la ausencia de este polipéptido, demostrado por "Western-blot" e inmunolocalización, en los animales no parasitados, indica que "p225" es un producto de nueva expresión asociado con esta parasitosis. Los hemocitos granulares son las células implicadas en la respuesta inflamatoria que "Tapes" spp. desarrolla contra los trofozoitos de "P. atlanticus", coincidiendo, de este modo, con el principal tipo hemocitario identificado en las cápsulas de moluscos. Sin embargo, los granulocitos que componen esta reacción celular exhiben características diferenciales respecto a los circulantes. Así, mientras los granulocitos circulantes de "T. semidecussatus" muestran gránulos de contenido flocular con un halo lúcido periférico, los granulocitos localizados en las proximidades de los trofozoitos se caracterizan por la presencia de numerosos gránulos de contenido homogéneo con abundantes membranas internas. Estas observaciones estructurales y los resultados obtenidos mediante el suero contra "p225" indican que una vez que los hemocitos granulares han accedido al tejido conjuntivo de los órganos parasitados sufren un proceso de rediferenciación dando lugar a un nuevo tipo celular de carácter secretor. La secreción ocurre en la estricta inmediación de los trofozoitos e implica la muerte de los granulocitos. Aunque tanto la respuesta defensiva elaborada por "T. semidecussatus", como la desarrollada por "T. decussatus" conllevan la encapsulación de los trofozoitos de "P. atlanticus", estas respuestas exhiben características diferenciales. Así, mientras la reacción celular de "T. semidecussatus" está organizada en áreas individualizadas, separadas por elementos del tejido conjuntivo aquélla de "T. decussatus" está compuesta por una única masa hemocitaria, sin fibras ni células de origen conjuntivo. Asimismo, los gránulos de los granulocitos rediferenciados de "T. decussatus" muestran menos membranas internas y, además, sin la típica ordenación en paralelo de "T. semidecussatus". Por último, aunque mediante el suero contra "p225" se observó inmunoreactividad en "T. decussatus" en los mismos compartimentos intra y extracelulares relacionados con la síntesis secreción y depósito de "p225" que lo fueron en "T. Semidecussatus", las estimaciones de la densidad de marca, para cada uno de los compartimentos, señalan una disminución relativa de ésta en "T. decussatus". Por otra parte, los resultados obtenidos tras la inoculación de cuerpos extraños en "T. semidecussatus" demuestran que el parasitismo de "P. atlanticus" induce específicamente la rediferenciación de los granulocitos infiltrados y la subsiguiente expresión de "p225"; ni heridas experimentales, ni la inoculación de material biológico de diferente tamaño, como bacterias, algas o hipnosporas no viables de "P. atlanticus", induce esta reacción celular específica. Así, aunque los hemocitos granulares asociados a las áreas inoculadas exhibieron actividad fagocítica, en ningún punto del experimento se observaron procesos de secreción por parte de estas células. En cualquier caso, estos hemocitos granulares no expresaron "p225", el componente mayoritario de la cápsula secretado por los granulocitos de la reacción celular. Tras la administración de 5'-bromodeoxiuridina, tan sólo un pequeño número de granulocitos de la reacción celular mostraron reactividad. Sin embargo, en el tejido conjuntivo epicárdico se observaron diferencias significativas entre los animales parasitados y aquéllos libres de la infección. Estos resultados evidencian que esta respuesta defensiva, basada en una reacción inflamatoria, es consecuencia del reclutamiento de hemocitos y de su rediferenciación, siendo repuestos los niveles hemocitarios mediante la actividad proliferativa de este tejido especializado.

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Protozoa of the genus "Perkinsus" (Apicomplexa. Perkinsea) are major disease agents in marine molluscs and they have been associated with large-scale mortality in bivalves and gastropods worldwide. The life cycle of those protozoa consists of trophozoiles, hipnospores and zoospores, trophozoites being the vegetative stage observed in the connective tissue of the hosts. The venerid clams "Tapes semidecussatus" and "T. decussates" develop an inflammatory response, based on a cellular reaction, against "Perkinsus atlanticus" infection. This reaction involves the infiltration of granule-containing haemocytes. The holocrine secretion by the granulocytes gives rise la the encapsulation of the trophozoites. The main component of the capsule is a polypeptide (p225) of about 225 kDa, which is slightly glycosylated. The immunolocalization of this polypeptide shows that p225 is stored in the granules of the granulocytes, and is secreted, in a polarized way, around the trophozoites, leading lo their encapsulation. Moreover, the absence of this polypeptide in non-parasitized specimens, confirmed by Western-blot and immunolocatization, indicates that p225 is produced "de novo" in response to the parasitosis. On the other hand, ultrastructural observations and the results obtained by means of the serum against p225 indicate that under parasite induction these infiltrated granular haemacytes redifferentiate, giving rise to secretory granulocytes. After 5'-bromodeoxyuridine administration, only a few granulocytes of the cellular reaction were labelled. However, significant differences between parasitized and non-parasitized specimens were observed in the epicardic connective tissue. These results show that this defensive reaction involves the infiltration and redifferentiation of granular haemocytes without cell division, and that haemocyte levels are recovered by means of the proliferative activity of this specialized tissue.

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Tesis Doctorals - Departament - Biologia Cel·lular

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Respuesta defensiva inducida por "Perkinsus atlanticus".  Reacción celular y expresión de p225 en "Tapes" spp