# name
Biophysical properties of single-stranded DNA studied with single-molecule force spectroscopy

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Facultat de Física

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] In this thesis, single-molecule experiments using LOT are employed to extract accurate information about the thermodynamics and kinetics of various molecular systems, with special emphasis on the elastic properties of single-stranded DNA (ssDNA). The thesis is divided in three parts. Part I provides a general description of the research field as well as the main theoretical framework for the basic concepts that will be developed in parts II and III. In Chapter 2 the miniTweezers and the experimental setup used throughout the thesis is described, as well as the physical basis of its working mechanisms, introducing the phenomenon of optical trapping. Chapter 3 contains a brief introduction of the biomolecules of study in this thesis, with an explanation of their historical discoveries, as well as their structure and function. The main focus of this chapter is on ssDNA, which is the main object of study of the thesis. Chapter 4 introduces the polymer models that are widely used in describing the elasticity of nucleic acids and proteins. Specifically, the Freely-Jointed Chain and Worm-Like Chain models are presented. Part II deals with the elasticity of single-stranded DNA. This is the main part of the thesis, and it includes chapters 5-7. Chapter 5 is about the study of the elasticity of ideal ssDNA chain, i.e. the one that can be modelled as ideal polymers (presented in Chapter 4). The study of the elasticity of different DNA sequences is presented. The blocking-splint oligo technique is described, a experimental technique developed for studying the elasticity of short (tens of bases) DNA molecules. This study shows the need of using extensible models to succesfully describe ssDNA elasticity over a large range of forces, which explains the previous discrepancies on the elastic parameters obtained in different studies. We also provide an explanation for the required extensibility of the model: a transition experienced at the nucleotide level: a change in DNA sugar pucker conformation. A simple two-states model is introduced and preeliminary results regarding its energetics are presented. The characterization of the ssDNA elasticity is central for the works developed in the following chapters. Chapter 6 studies the stacking-unstacking transition for ssDNA, previously observed for certain sequences (mainly purine-rich ones). Several molecules, with different degrees of stacking, are studied by obtaining their force extension curves (FECs). A cooperative helix-coil model including heterogeneity is developed and used to fit the obtained FECs, allowing to obtain elastic parameters to describe the stacked chain. The salt dependence of the unstacking transition is also measured by studying two of the sequences by varying the salt concentration over two decades. The free energy of formation of dsDNA duplexes depends on the salt concentration. The obtained salt dependence on the stacking free-energy of ssDNA provides a possible explanation for the salt dependence of duplex formation. Chapter 7 deals with the non-specific structures that arise at low forces and high salt concentration when pulling ssDNA molecules longer than $\sim 100$ bases. A helix-coil model with cooperativity is proposed and used to extract some mean-field characteristics of these structures. 8 different sequences are studied, characterizing their elasticity and deviation from the ideal elastic behaviour. The results for a $14$kb molecule for 3 decades of varying \ce{NaCl} and \ce{MgCl2} are also shown. All experimental FECs are fitted to the helix-coil model. The model can be used to predict the formation of secondary structures at zero force. A comparison between the predicted structures from the model and those obtained from Mfold is also investigated. Part III contains two studies which also need of the correct determination of ssDNA elasticity. In Chapter 8, we study the interaction between the RecQ helicase from E. coli and DNA, i.e. how the RecQ unwinds double-stranded DNA molecules, releasing single-stranded DNA. We obtain some of its kinematic properties as well as study the entropy production of the system using the Fluctuation Theorem. In Chapter 9, the effect of DNA mismatches, i.e. non complementary base pairing, on the stability of DNA is studied. To do so, two types of experiments on several DNA sequences are performed: stretching and releasing the molecule by moving the optical trap (pulling experiments) and monitoring the folding/unfolding of the molecule passively (hopping experiments).

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] En aquesta tesi hem realitzat experiments fent servir pinces òptiques per tal d’extreure informació precisa sobre les propietats termodinàmiques i cinètiques de diferents sistemes moleculars, posant especial èmfasi en les propietats elàstiques de la cadena simple d’ADN (ssDNA, pel seu acrònim en anglès). La tesi es troba dividida en tres parts. A la primera part s’introdueix de forma general el camp de recerca dels experiments de molècula única, així com s’expliquen els conceptes més bàsics que es desenvoluparan en les parts II i III. La configuració experimental emprada al llarg de tota la tesi, les pinces òptiques, s’introdueix al capítol 2. Per a fer-ho, s’expliquen els principis físics de funcionament de les pinces, que es basen en l’atrapament òptic. Breument, la focalització d’un feix de llum d’alta intensitat permet atrapar i exercir forces en micropartícules dielèctriques (pilotes fetes de plàstic de la mida d’un bacteri), que són recobertes químicament de manera que la molècula d’estudi pot estirar-se, de forma individual, repetides vegades. El capítol 3 conté una breu introducció a les biomolècules que apareixen en aquesta tesi, amb una breu explicació de la seva descoberta, així com la seva estructura i funció (íntimament relacionades). Ens centrem en la descripció de la ssDNA que és el principal objecte d’estudi de la tesi. Al capítol 4 s’introdueixen els models de polímers que s’empren habitualment per a descriure l’elasticitat d’àcids nucleics i proteïnes. En concret, es descriuen els models de la Freely-Jointed Chain i la Worm-Like Chain. La Part II tracta de l’elasticitat de la ssDNA, i inclou els capítols 5, 6 i 7. El capítol 5 es basa en la caracterització de l’elasticitat de la cadena ideal de ssDNA, és a dir, aquella que pot ser modelitzada pels polímers ideals introduïts en el capítol 4. S’estudia l’elasticitat de diferents seqüències de ssDNA, introduint un nou mètode experimental, blocking-splint oligo, per tal d’ampliar el rang de forces estudiat habitualment en molècules curtes (d’una longitud de desenes de bases) de ssDNA. L’estudi mostra la necessitat d’emprar models elàstics extensibles per a la correcte caracterització de l’elasticitat de ssDNA, que explica les discrepàncies existents entre els paràmetres elàstics trobats a la literatura. També hipotetitzem que l’extensibilitat del model pot ser explicada gràcies a la transició experimentada a nivell de nucleòtids: el canvi que experimenta la distància interfosfat de l’ADN es veu modificada segons quina sigui la configuració de l’anell de desoxiribosa. Tot i que és un fenomen molt més conegut en la cadena doble d’ADN, l’apilament-desapilament de bases també s’ha observat en certes seqüències de ssDNA (especialment les que són riques en contingut de purines). Al capítol 6 s’estudien quatre molècules amb un grau d’apilament diferent a partir de les seves corbes força-extensió (FECs). Es desenvolupa un model helix-coil (hèlix-cabdell) per tal d’ajustar les FECs, fet que permet d’obtenir, indirectament, les propietats elàstiques de la cadena apilada. També s’estudia la dependència d’aquesta transició variant la concentració de sal dels experiments en més de dos ordres de magnitud. A través d’aquests experiments, trobem una dependència amb la concentració de sal de l’energia lliure de formació de l’apilament de la ssDNA, fet que ens permet explicar, parcialment, la dependència que es troba en la literatura per la hibridació de la cadena doble d’ADN. El capítol 7 tracta de la formació d’estructures no específiques que apareixen a forces baixes i a concentració de sal alta per a molècules de ssDNA de més de ~100bases. Es proposa un model helix-coil amb cooperativitat per tal de caracteritzar propietats de camp mitjà de les estructures estudiades. S’estudien vuit seqüències diferents, entre 120 i ~14000 bases, i es caracteritza el seu desviament respecte de la corba elàstica ideal amb el model. També s’estudia la dependència de l’estructura secundària de la ssDNA en funció de la concentració de la sal. Analitzant experiments variant la concentració de MgCl2 i NaCl, aconseguim reproduir les FECs a partir de fer dependre els paràmetres del model amb la sal. Finalment, el model desenvolupat ens permet predir la formació d’estructura secundària a força zero (fet que no podem detectar directament a partir d’experiments d’espectroscopia de forces). Es comparen les previsions del model amb les trobades per Mfold, trobant una compatibilitat per als resultats per a molècules de de menys de 1000 bases. La darrera part se centra en col·laboracions que he fet durant a tesi i que necessiten una determinació precisa de les propietats elàstiques de la ssDNA. Al capítol 8 s’estudia la interacció entre l’helicasa del bacteri E. coli i l’ADN, que s’encarrega d’obrir la cadena doble d’ADN, alliberant ssDNA. S’extreuen les seves propietats cinètiques, com la velocitat de translocació – obtenim, independentment de la força aplicada, d’uns 50bp/s, d’acord amb la literatura –. També n’estudiem les seves propietats termodinàmiques, a partir del Teorema de Fluctuació. Finalment, al capítol 9 s’estudien els efectes de certs defectes en molècules d’ADN. A partir d’experiments fora de l’equilibri s’extrau la penalització que suposa per a la hibridització d’ADN la presència d’aquestes bases no complementàries (és a dir, que no són enllaços de A-T o G-C).

# metadata.dc.rights[].value
cc by-nc-sa (c) Viader Godoy, Xavier, 2021

# metadata.dc.title[].value
Biophysical properties of single-stranded DNA studied with single-molecule force spectroscopy