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Caracterización funcional y regulación de los sistemas génicos implicados en el metabolismo de alantoina en "Klebsiella pneumoniae"

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[spa] Este estudio se enfoca en el metabolismo de alantoina, y su derivado alantoato, como fuentes de nitrógeno en la enterobacteria “Klebsiella pneumoniae”. Los genes implicados en dicho metabolismo están agrupados en dos clusters diferentes. La primera agrupación denominada “hpxSAB-hpxC-guaD”, contiene los genes implicados en la degradación de alantoina a alantoato y el gen que codifica guanina desaminasa. En la segunda agrupación se encuentran los genes hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ que están implicados en el metabolismo de alantoato.

El sistema hpxSAB-hpxC-guaD está formado por tres unidades transcripcionales de las cuales hpxC y hpxSAB se transcriben a partir de promotores dependientes de la subunidad σ(70) de la RNA polimerasa mientras que guaD presenta un promotor σ54. Por similitud de secuencia proponemos que el gen hpxA codifica una racemasa que permitiría la formación de (S)‐alantoina. El producto del gen hpxB es una alantoinasa que cataliza la degradación de alantoina a alantoato, esta enzima presenta homología con la nueva alantoinasa (PuuE) independiente de metales identificada en “Pseudomonas fluorescens”. En base a similitud de secuencia proponemos que el gen hpxC codifica una alantoina permeasa que permitiría la entrada a la célula de la alantoina presente en el medio extracelular. El gen guaD codifica una guanina desaminasa que cataliza el paso de guanina a xantina. El gen hpxS codifica una proteína de la familia de reguladores GntR que podría tener un papel dual, actuando como represor en ausencia de alantoina y como activador cuando este metabolito está presente en el medio. HpxS se une a dos sitios contiguos, S1 y S2, cubriendo las cajas ‐ 10 y ‐35 del promotor del operón hpxSAB.

La caracterización de la regulación del sistema se ha llevado a cabo mediante diversas metodologías, analizando diferentes cepas mutantes y distintas condiciones de disponibilidad de nitrógeno. Los resultados obtenidos muestran que el cluster hpxSAB-hpxC-guaD está sometido a una doble regulación, la llevada a cabo por el sistema global del nitrógeno y la regulación específica de la vía. La unidad transcripcional hpxSAB es la más regulada, su expresión se induce cuando la alantoina es la fuente de nitrógeno a diferencia de las otras dos unidades transcripcionales hpxC y guaD cuya expresión no es inducida por este metabolito.

La transcripción del gen guaD está regulada por la disponibilidad de nitrógeno por acción de la proteína NtrC. La expresión del gen hpxC parece ser constitutiva. Para que la inducción del operón hpxSAB sea completa es necesaria la presencia de las proteínas HpxS y NAC, las cuales podrían interactuar en presencia de alantoina.

En lo que concierne al sistema hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ, se identificaron tres unidades transcripcionales de las cuales hpxFGHIJK y hpxWXYZ se transcriben a partir de promotores dependientes de la subunidad σ70 de la RNA polimerasa mientras que en el promotor de hpxU se han identificado secuencias de unión tanto para σ(54) como para σ(70). Por similitud de secuencia se propone que los genes hpxFGHI codifican un sistema de transporte tipo ABC que permitiría la entrada del alantoato a la célula. Los genes hpxJ y hpxK codifican una ureidoglicina aminotransferasa y una alantoato amidohidrolasa respectivamente. La proteína HpxK hidroliza el alantoato para producir ureidoglicina, posteriormente HpxJ cataliza la transaminación entre la ureidoglicina y un α‐cetoácido para producir oxalurato y el correspondiente aminoácido. Por similitud de secuencia se propone que las proteínas codificadas por los genes hpxW y hpxY podrían ser una oxamato y una oxalurato amidohidrolasa respectivamente. HpxZ podría estar implicada en la utilización de oxalurato. El gen hpxU codifica una proteína reguladora perteneciente a la familia RpiR que en ausencia de alantoato, reprime la expresión del operón hpxFGHIJK además de regular su propia transcripción.

La regulación del cluster hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ se realiza por el sistema global de nitrógeno y por el regulador específico. El alantoato induce la expresión de los genes hpxU y hpxFGHIJK. La transcripción del gen hpxU está levemente regulada por la disponibilidad de nitrógeno.

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[eng] This study is focused in allantoin and allantoate metabolism as nitrogen source in Klebsiella pneumoniae. Genes implicated in this metabolism are grouped in two different clusters: hpxSAB-hpxC-guaD and hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ. The first one transforms allantoin into allantoate, while the second one is responsible for allantoate degradation.

hpxSAB-hpxC-guaD system includes an allantoin racemase, an allantoinase, an allantoin permease, a guanine deaminase and a transcriptional regulator that belongs to the GntR family. The transcriptional regulation of this cluster is carried out by the NTR system and the specific regulator HpxS. The mainly regulated transcriptional unit is hpxSAB, wich needs the presence of NAC, HpxS and allantoin for full induction. The expression of hpxC is constitutive, while guaD is regulated by the protein NtrC.

On the other hand, hpxFGHIJK-hpxU-hpxWXYZ system includes an ureidoglycine aminotransferase, an allantoate aminohydrolase and a transcriptional regulator that belongs to the RpiR family. An analysis by sequence comparison suggests that in this cluster there might be as well an ABC-type transport system, an oxalurate aminohydrolase and an oxamate aminohydrolase. The transcriptional regulation of this cluster is carried out by the NTR system and the specific regulator HpxU. In the absence of allantoate, the protein HpxU represses transcription of hpxU y hpxFGHIJK.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Caracterización funcional y regulación de los sistemas génicos implicados en el metabolismo de alantoina en "Klebsiella pneumoniae"