# name
Generation of signal3-based CAR-T cells for cancer treatment

# metadata.dc.contributor.other[].value
Universitat de Barcelona. Facultat de Medicina i Ciències de la Salut

# metadata.dc.description.abstract[].value
[eng] Adoptive cell therapy using chimeric antigen receptor (CAR)-T cells has revolutionized the field of cancer therapies. CARs are genetically engineered synthetic receptor that combine an antibody-derived extracellular domain with intracellular signaling modules derived from endogenous T-cell receptors and costimulatory molecules. Expression of a CAR in T lymphocytes redirects their specificity toward tumor-associated antigens, triggering T cell activation and cytotoxicity. To date, CAR-T cell therapy has demonstrated remarkable success in the treatment of several hematologic malignancies, as B-cell leukemias and lymphomas. Importantly, the persistence of CAR-T cells has been shown to correlate with clinical responses. Despite these successes, limited CAR-T cell persistence in some patients remains a critical challenge. These limitations are further magnified in solid tumors, where additional barriers as immunosuppressive tumor microenvironment and inadequate CAR-T cell infiltration significantly impair therapeutic efficacy. The principal aim of this thesis was to enhance the proliferation, persistence and overall functionality of CAR-T cells for cancer treatment. Most CAR constructs currently in clinical trials provide only the first two signals required for T cell activation: TCR-like activation (signal 1) and costimulation (signal 2). However, these designs lack the third signal, mediated by cytokine receptor engagement, which is essential for complete T cell activation and differentiation. We hypothesized that delivering signal 3 through IL-7Rα-derived signaling domains could enhance CAR-T cell activation and their overall persistence and functionality. To address that, we evaluated multiple strategies to deliver IL-7R signaling to CAR-T cells, either in an inducible or in a constitutive manner. Summary First, we designed fifth-generation CAR constructs incorporating IL-7Rα signaling motifs into ICOS- or CD28-based second-generation CARs. These designs, however, did not confer a measurable advantage compared to conventional second-generation CAR-T cells. Next, we developed chimeric cytokine receptors (CCR) by coupling an scFv or a ligand-responsive exodomain to the IL-7Rα intracellular domain. Similarly to fifth-generation CARs, these CCRs failed to activate STAT5 signaling after antigen recognition, whether expressed alone or in combination with a first-generation CAR. To deepen our comprehension on the lack of signaling, we explored strategies addressing homo- and heterodimerization requirements, including tonic-signaling models, γc bioavailability and structural constraints. Finally, we engineered constitutively active IL-7Rα variants (C7R) incorporating either homo- or heterodimerizing mutations. These mutated receptors markedly enhanced CAR-T cell proliferation and long-term cytotoxicity. Importantly, when coexpressed with first- or second-generation CARs, C7Rs improved T-cell persistence both in vitro and in a leukemia xenograft mouse model. In summary, our findings demonstrate that delivering signal 3 through inducible chimeric receptors remains challenging; however, constitutively active receptors have demonstrated to enhance CAR-T cell function by promoting proliferation, persistence and sustained antitumor activity.

# metadata.dc.description.abstract[].value
[cat] La teràpia cel·lular adoptiva amb limfòcits T que expressen receptors d’antigen quimèrics (CAR-T) ha revolucionat el camp de les teràpies contra el càncer. Els CARs són receptors sintètics d’enginyeria genètica que combinen un domini extracel·lular derivat d’anticossos amb diferents mòduls de senyalització intracel·lulars procedents dels receptors de limfòcits T endògens i de molècules coestimuladores. L’expressió d’un CAR en limfòcits T redirigeix la seva especificitat cap a antígens associats al tumor, desencadenant l’activació i la citotoxicitat dels limfòcits T. Fins ara, la teràpia amb cèl·lules CAR-T ha demostrat un èxit remarcable en el tractament de diverses neoplàsies hematològiques, com les leucèmies de cèl·lules B i els limfomes. És important destacar que la persistència de les cèl·lules CAR-T s’ha relacionat amb les respostes clíniques més favorables. Malgrat aquests èxits, la persistència limitada de les cèl·lules CAR-T en alguns pacients continua sent un repte crític. Aquestes limitacions es veuen encara més accentuades en els tumors sòlids, on barreres addicionals, com el microambient tumoral immunosupressor i la infiltració insuficient de les cèl·lules CAR-T, deterioren significativament l’eficàcia terapèutica. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat potenciar la proliferació, la persistència i la funcionalitat global de les cèl·lules CAR-T per al tractament del càncer. La majoria de dissenys de CARs que es troben actualment en ús clínic només proporcionen els dos primers senyals necessaris per a l’activació dels limfòcits T: l’activació derivada del TCR (senyal 1) i la coestimulació (senyal 2). Tanmateix, la majoria d’aquests dissenys manquen el tercer senyal, que ve donat pel reconeixement de receptors de citocines i resulta essencial per l’activació i diferenciació dels limfòcits T. Vam plantejar la hipòtesi que la incorporació del senyal 3 mitjançant dominis de senyalització derivats del IL-7Rα podria millorar l’activació dels CAR-T, així com la seva persistència i funcionalitat. Per abordar aquesta hipòtesi, vam avaluar diverses estratègies per dotar els CAR-T de senyalització del IL-7R, ja fos de manera induïble o constitutiva. En primer lloc, vam dissenyar CAR-T de cinquena generació mitjançant la incorporació de motius de senyalització del IL-7Rα en CARs de segona generació basats en ICOS o CD28. Aquests dissenys, però, no van conferir cap avantatge en comparació amb els CAR-T convencionals de segona generació. Posteriorment, vam desenvolupar receptors quimèrics de citocines (CCR) fusionant un scFv o un exodomini dependent de lligand al domini intracel·lular del IL-7Rα. De manera similar als CARs de cinquena generació, aquests CCRs no van aconseguir activar la via de senyalització de STAT5 després del reconeixement de l’antigen, ja fos expressats sols o en combinació amb un CAR de primera generació. Per tal d’aprofundir en aquesta manca de senyalització, vam explorar estratègies per adreçar potencials problemes d’homodimerització i d’heterodimerització, incloent-hi models de senyalització tònica, la biodisponibilitat de γc i les restriccions estructurals. Finalment, vam dissenyar variants constitutivament actives del IL-7Rα (C7R) que incorporaven mutacions d’homodimerització o d’heterodimerització. Aquests receptors modificats van millorar notablement la proliferació dels CAR-T i la seva citotoxicitat a llarg termini. Quan vam expressar aquests receptors conjuntament amb CARs de primera o segona generació, van augmentar la persistència dels limfòcits T tant in vitro com en un model murí de leucèmia. En resum, els nostres resultats demostren que la transmissió del senyal 3 mitjançant receptors quimèrics induïbles continua sent un repte; tanmateix, els receptors constitutivament actius han demostrat millorar la funció de les cèl·lules CAR-T promovent la proliferació, la persistència i una activitat antitumoral sostinguda.

# metadata.dc.source[].value
Tesis Doctorals - Facultat - Medicina i Ciències de la Salut

# metadata.dc.title[].value
Generation of signal3-based CAR-T cells for cancer treatment