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Comunicación microbiota-epitelio intestinal: Identificación de proteínas secretadas por el probiótico Escherichia coli Nissle 1917 y caracterización funcional de la Serin Proteasa Sat

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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[spa] El intestino de los mamíferos es uno de los ecosistemas más densamente poblados. Los microorganismos que lo habitan constituyen la denominada microbiota, que cumple importantes funciones para el huésped. Alteraciones en la composición de la microbiota pueden ser la base de diversas patologías, por ello la administración de probióticos se contempla como una estrategia preventiva o terapéutica. Con la finalidad de profundizar en aspectos moleculares de la comunicación microbiota-epitelio intestinal, hemos abordado estudios sobre las proteínas secretadas por la cepa probiótica E. coli Nissle 1917 (EcN). El objetivo de este trabajo fue abordar estudios encaminados a caracterizar el secretoma de la cepa EcN, establecer qué proteínas son secretadas a través de OMVs y proceder a la caracterización funcional de una de ellas. El análisis in silico del proteoma de OMVs, así como del secretoma global de la cepa EcN indican que las proteínas identificadas desempeñan funciones relacionadas con la adhesión, modulación del sistema inmune o supervivencia de la bacteria en nichos del huésped. El análisis protéomico de OMVs obtenidas en diferentes medios evidenciaron que el medio de crecimiento influye en la composición de las proteínas exportadas a través de vesículas, lo que puede repercutir en el tipo y diversidad de funciones asociadas a estas estructuras. Una de las proteínas identificada en el sobrenadante de cultivos de la cepa EcN en medio LB fue la proteína Sat (serin protease autotransporter toxin), codificada por un gen presente en la isla genómica II de esta cepa. Estudios previos habían descrito esta proteína sólo en cepas patógenas, no existiendo referencias sobre la función de Sat en la cepa probiótica. Por tanto, nuestro objetivo fue analizar si Sat es expresada en el tracto intestinal y secretada en forma activa por la cepa EcN. Con este análisis se pretendía establecer si Sat ha de ser considerada un factor de virulencia o, por el contrario, un factor fitness que contribuye a una mejor colonización a nivel intestinal. Los resultados obtenidos en este trabajo nos permitieron afirmar que Sat, no debe ser considerada un factor de virulencia. La proteína es secretada y expresada en forma funcional. Sin embargo, a pesar de poseer actividad serin proteasa y actuar sobre la permeabilidad paracelular, este último efecto es compensado por otros componentes secretados por la cepa probiótica. La proteína Sat, no parece estar implicada en la formación de biofilms, ni posee actividad citotóxica sobre células Caco-2 polarizadas. Estudios de colonización en modelos murinos permitieron establecer además que Sat no es requerida para la colonización intestinal. Sin embargo quedó demostrado tanto en modelos in vivo como en modelos de competición in vitro en crecimiento planctónico, que la cepa EcNsat::cm es capaz de desplazar a la EcN wild type, además de desplazar más eficientemente a una cepa enteropatógena como EPEC.

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[eng] Microorganisms that inhabit the mammalian intestine are called microbiota, which performs important functions for the host. Changes in microbiota composition are the basis of various pathologies. Thus, probiotic administration is seen as a preventive or therapeutic strategy. To deep in molecular aspects of probiotic/ intestinal epithelium cross-talk, we addressed studies to characterize proteins secreted by the probiotic E. coli Nissle 1917 (EcN). Proteomic analysis of outer membrane vesicles (OMVs) and the global secretome of EcN indicated that the identified proteins perform functions related to adhesion, immune system modulation or bacterial survival in host niches. Proteomic analysis of OMVs showed that the growth medium influences the protein composition of these vesicles, which can affect the type and variety of functions associated with these structures. One protein identified in the EcN secretome was Sat (serine protease autotransporter toxin). This protein has been proposed to act as a virulence factor in pathogens but its role in probiotic strains has not been addressed so far. Our aim was to characterize Sat from EcN to establish whether it is a virulence or a fitness factor that contribute to better colonization of gut. Our results show that Sat is expressed and secreted as an active serine protease. Its effect on paracellular permeability seems to be compensated by other factors secreted by this probiotic. Moreover, Sat does not display cytotoxic activity on polarized Caco-2 cells. Analysis of biofilm formation and studies using murine models allowed us to establish that Sat is not required for intestinal colonization. However, in vivo colonization competition experiments showed that the EcNsat::cm outcompete the wild type strain. In vitro experiments confirmed that EcNsat::cm is able to displace in planktonic growth wild type EcN as well as enteropathogenic E. coli (EPEC). Results presented rule out that Sat is a virulence factor in strain EcN.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Farmàcia)

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Comunicación microbiota-epitelio intestinal: Identificación de proteínas secretadas por el probiótico Escherichia coli Nissle 1917 y caracterización funcional de la Serin Proteasa Sat