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Caracterización del transportador SteT: primer modelo procariota de la familia LAT

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Universitat de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

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[spa] La proteína ykbA de "Bacillus subtilis", purificada y reconstituida en proteoliposomas (PLs), presenta actividad de intercambio de L-serina, L-threonina y L-aminoácidos aromáticos. Por ello la renombramos como SteT (Serine/threonine exchanger Transporter). Los estudios cinéticos de la actividad de SteT son compatibles con un mecanismo secuencial de intercambio. SteT se agrupa filogenéticamente dentro de la familia LAT. Por todo ello, SteT es el primer homólogo procariota de la familia LAT que ha sido identificado y caracterizado. Proponemos SteT como modelo procariota para el estudio funcional y estructural de la familia LAT. Los estudios estructurales de SteT mediante electroforesis no desnaturalizante y TEM con tinción negativa y con criofractura en PLs indican que el intercambiador es funcional como monómero. SteT tiene apariencia de donut elíptico con diámetros exteriores de ~6 y ~7 nm. El residuo C291 en el segmento transmembrana (TM) VIII de SteT es la única diana de inactivación por MTSET y de activación por DTT. El sustrato L-serina protege de la inactivación por MTSET. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de MTSET al residuo. El segmento TM VIII presenta dos caras funcionalmente diferenciables con periodicidad de hélice α. Una cara está formada por los residuos I285, I288, L292, K295 y F299 que mutados a cisteína muestran inhibición por MTSET y son insensibles a DTT. La otra cara, adyacente a la anterior, está formada por los residuos S287, G290, G294 y S298 que mutados a cisteína muestran activación por DTT y son insensibles a MTSET. Los residuos I284 y C291 poseen características de ambas ya que se inactivan por MTSET y se activan por DTT. DTT activa ~20 veces SteT cysless G294C en PLs, muy probablemente incrementado la Vmáx sin afectar la KM aparente. Esta activación es protegible por el sustrato L-serina con una EC50 similar a su KM aparente. Por tanto, el sustrato bloquea directamente o provoca un cambio conformacional que bloquea la accesibilidad de DTT al residuo. La mutación K295C, tanto en su entorno cysless como wt, genera un transportador ~50 y ~260 veces más rápido que SteT y SteT cysless respectivamente. La mutación K295G provoca un efecto muy inferior y la mutación K295L rinde un transportador inactivo. Estos datos sugieren que no hay una relación directa entre el tamaño de la cadena lateral en la posición 295 y la actividad de SteT, si no que la presencia de cisteína es la causante del aumento de actividad. Los residuos I285 y K295 parecen presentar interacción con la cadena lateral del sustrato ya que las mutaciones I285C y K295C producen un cambio dramático en el patrón de cis-inhibición. En estos mutantes la mayoría de los aminoácidos estudiados inhiben ampliamente el transporte de L-serina, con la excepción de L-prolina, L-hidroxiprolina, L-glutamato y glicina. En este sentido, SteT cysless K295C presenta un claro cambio de especificidad de sustrato ya que, a diferencia de SteT, transporta L-arginina. El hecho de que I285 y K295 disten ~16 Å indicaría la existencia de al menos dos lugares de unión independientes de la cadena lateral del sustrato, contradiciendo el modelo de "Alternating access".

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[eng] ykbA, a "Bacillus subtilis" protein was purified and reconstituted in proteoliposomes (PLs) showing a L-serine, L-threonine and aromatic L-aminoacids exchange activity. We rename it as SteT (Serine/threonine exchanger Transporter). The kinetic studies of SteT activity are compatible with a sequential mechanism of exchange. SteT belongs philogenetically to LAT family, so SteT is the first prokaryotic member of LAT family that has been identified and characterized. The structural studies of SteT using native electrophoresis, negative staining and freeze fracture TEM in PLs show that it is functional as monomer. SteT looks like an elliptic donut with external diameters of ~6 and ~7 nm. The residue C291, located in the transmembrane segment (TM) VIII of SteT, is the unique target of inactivation by MTSET and of activaction by DTT. L-serine protects the MTSET inactivation. The TM segment VIII has two differentiable faces with α-helix periodicity. One is formed by I285, I288, L292, K295 and F299. These residues mutated to cysteine show MTSET inhibition and DTT insensitivity. The other, adjacent to the first, is formed by S287, G290, G294 and S298. These residues mutated to cysteine show DTT activation and MTSET insensitivity. The residues I284 and C291 have MTSET inhibition and DTT activation. DTT activates ~20 fold SteT cysless G294C in PLs. This activation is protected by L-serine with an EC50 similar to its apparent KM. The mutation K295C, in cysless and wt environments, causes a transporter ~50 and ~260 fold faster than SteT and SteT cysless respectively. The mutation K295G causes a lower effect and the mutation K295L yields and inactive transporter. These data suggest that the presence of cysteine is the cause of increased activity. The residues I285 and K295 seem to have interaction with the substrate's side chain because the I285C and K295C mutations cause a dramatic change in the cis-inhibition pattern. In this sense, SteT cysless K295C shows a clear change of substrate specificity because it transports L-arginine despite SteT. I285 and K295 are ~16 Å away, indicating the existente of at least two independent binding sites for the substrate side chain, contradicting the Alternating access model.

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Tesis Doctorals - Departament - Bioquímica i Biologia Molecular (Biologia)

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Caracterización del transportador SteT: primer modelo procariota de la familia LAT