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Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes naturales. Citotoxicidad y capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo en modelos celulares.

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Universitat de Barcelona. Departament de Fisiologia (Farmàcia)

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[spa] El estrés oxidativo, el desequilibrio que se produce en el organismo entre sustancias oxidantes, principalmente especies reactivas del oxígeno (ROS), y antioxidantes, puede producir daños celulares que desencadenen diversos procesos patológicos. De ahí el creciente interés de la ciencia y la industria por obtener sustancias de origen natural (principalmente procedentes de residuos agrarios y de productos de desecho naturales) encaminadas a la prevención y tratamiento de estas alteraciones producidas por los ROS. Entre estas sustancias destacan los polifenoles y entre ellos, los flavonoides, con reconocidas propiedades antioxidantes y posible papel en la prevención de enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y cáncer.  Se ha evaluado la citotoxicidad sobre células normales (no tumorales) y se ha caracterizado la actividad antioxidante de toda una serie de compuestos de naturaleza polifenólica obtenidos de diferentes fuentes naturales. Una primera serie de compuestos se obtuvo a partir de la despolimerización de flavanoles (catequinas) poliméricos procedentes de extractos vegetales, principalmente bagazo de uva, en presencia de cisteína y cisteamina. La segunda colección de compuestos está formada de fracciones polifenólicas (proantocianidinas) extraídas de bagazo de uva, de corteza de pino y de corteza del arbusto hamamelis; las diferencias estructurales de estas fracciones vienen dadas principalmente por el diferente grado de polimerización y diferente porcentaje de grupos galato que presentan.  Se han planteado los siguientes objetivos y se han extraído las siguientes conclusiones de ellos: 1) El potencial efecto antioxidante de los derivados flavanólicos y los extractos de proantocianidinas se ha evaluado mediante su efecto protector frente a la hemólisis y la peroxidación lipídica inducida por radicales libres en eritrocitos y mediante la protección ejercida frente a la citotoxicidad por peróxido de hidrógeno en líneas celulares no tumorales. Tanto los derivados semisintéticos de epicatequina como los extractos de procianidinas, han mostrado, con diferente eficacia, una buena actividad antioxidante en los diferentes modelos celulares; en general, los grupos galato y el grupo no fenólico en el caso de los conjugados con aminoácidos y el grado de polimerización y porcentaje de galoización en el caso de las fracciones, son las principales características estructurales que determinan la actividad de estos compuestos. 2) La toxicidad se ha evaluado mediante ensayos de citotoxicidad utilizando el ensayo de viabilidad de captación del Rojo Neutro en fibroblastos 3T3 y en queratinocitos HaCaT y se ha caracterizando el potencial efecto genotóxico con la técnica del Comet. La presencia de galatos incrementa el efecto citotóxico de los compuestos y, en general, los compuestos más potentes como antioxidantes son también los más citotóxicos, debido al efecto prooxidante de los grupos galato; las concentraciones antioxidantes efectivas fueron inferiores a las concentraciones citotóxicas garantizando así la seguridad de estos productos. Los estudios previos de genotoxicidad muestran que los compuestos estudiados resultan genotóxicos para células no tumorales a concentraciones muy elevadas, alejadas de las concentraciones antioxidantes efectivas. 3) Finalmente, se ha iniciado la caracterización de la interacción de los derivados flavanólicos con la membrana eritrocitaria mediante estudios de morfología celular, de oxidación de proteínas y de fluidez de membrana. Los compuestos modificaron la fluidez de membrana y la morfología de los eritrocitos, pero no alteraron el patrón proteico ni se observó que revertieran los efectos nocivos de los oxidantes empleados.  Así, se puede concluir que la galoización es una característica estructural fundamental para explicar los efectos de los compuestos de naturaleza polifenólica a nivel celular y que toda esta serie de sustancias polifenólicas procedente de diversas fuentes naturales, presenta actividad antioxidante en diversos modelos celulares en un rango de concentraciones seguro para células normales.

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[eng] The imbalance between oxidant substances production, mainly reactive oxygen species (ROS), and antioxidants in the body, namely oxidative stress, is associated with several pathological processes. Therefore, there is an increasing interest in obtaining natural compounds (mainly from agricultural by-products and other natural wastes) to deal with these ROS-induced alterations. Among these substances, polyphenolic compounds and specially flavonoids, are recognized by their antioxidant properties and putative role in cardiovascular, neurodegenerative diseases and cancer prevention.  We have evaluated the cytotoxicity on non tumoral cells and the antioxidant activity of a serie of flavanol cojugates (catechins), obtained from vegetable extracts through depolimerisation with cysteine derivatives, and several polyphenolic fractions extracted from grape pomace, pine bark and witch hazel ("Hamamelis virginiana") bark. 1) Antioxidant activity was studied by induction of oxidative stress in different cell models by radicals. All compounds showed antioxidant activity and the galloylated compounds were the most effective. 2) Cytotoxicity was evaluated using Neutral Red Uptake assay in fibroblast 3T3 and keratinocytes HaCaT. The strongest antioxidant products were also the most cytotoxic, especially due to the antioxidant power of the gallate group molecules, which is also responsible for the increase in their cytotoxicity. Compounds showed high antioxidant capacity in a concentration range that is not harmful to normal cells. Genotoxicity studies by Comet assay indicated that flavanic conjugates had genotoxic activity at high concentrations. 3) The characterization of the erythrocyte membrane interaction (by means of SEM, SDS-Page electrophoresis and fluidity assays) showed that these compounds modified membrane fluidity and erythrocyte morphology but not their protein pattern.  We can conclude that the flavanic conjugates with cystein derivatives and polyphenolic fractions from natural sources, presented antioxidant activity in several cellular models in a concentration range safe for normal cells. The compound structures mainly responsible for their activity were gallate groups and non phenolic moiety to flavanol conjugates, whereas percentage of galloylation and degree of polymerization were important in the case of polyphenolic fractions.

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Tesis Doctorals - Departament - Fisiologia (Farmàcia)

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Caracterización de derivados polifenólicos obtenidos de fuentes naturales. Citotoxicidad y capacidad antioxidante frente a estrés oxidativo en modelos celulares.