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Deciphering the structure and dynamics of the vault particles

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Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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[eng] The vault particle, with a mass of 10 MDa and dimensions of 70 nm x 40 nm x 40 nm, is the largest ribonucleoprotein described in the eukaryotic kingdom. The vault shell is organized in two identical moieties, each consisting of 39 copies of the major vault protein (MVP, 100 kDa), which assemble to form a barrel-like cage with an enormous interior volume. The telomerase associated protein 1 (TEP1, 290 kDa), the vault poly (ADP)- ribose polymerase (vPARP, 193 kDa), as well as several short untranslated RNAs (vRNA) are localized in the interior volume of the particle, as minor components. Vaults are present and widely conserved in most eukaryotes, suggesting an essential biological role, which, however, remains poorly understood. In a previous work, using a combination of vault recombinant reconstitution, biophysics and cryo-electron microscopy (cryo-EM) techniques, we characterized the structural dynamics of rat vaults, suggesting a mechanistic model for the vault opening-closing cycle with functional implications for cargo encapsulation, transport, and delivery. Dictyostelium discoideum is the only organism described so far possessing two closely related isoforms of MVP (MVPα and MVPβ), and our previous findings demonstrated that both isoforms are essential for vault assembly. Solving the structure of Dictyostelium vaults would shed new light on the evolutionary relationships between these singular particles among lower and higher eukaryotes. In this work, we solved the cryo-EM structures of recombinant Dictyostelium vaults, unbound (3.8 Å resolution) and bound to a nanobody (5.1 Å resolution), recognizing a myc-tag, artificially inserted in an exposed loop of the R6 repeat in MVP β, to differentiate the two isoforms. In parallel, with the aim of contributing to the understanding of the role of vaults in intracellular transport, we performed a preliminary characterization of the structure and interactions of vault particles in their native environment by in situ cryo-electron tomography (cryo-ET).

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[spa] La partícula vault, con una masa de 10 MDa y unas dimensiones de 40 nm x 40 nm x 70nm, es la mayor ribonucleoproteína descrita en el reino eucariota. La partícula está organizada en dos mitades idénticas, compuesta cada una por 39 copias de la major vault protein (MVP, 100 kDa), las cuales se ensamblan para formar una estructura en forma de barril con un voluminoso espacio en su interior. La telomerase associated protein 1 (TEP1, 290 kDa) y la vault poly (ADP)-ribose polimerasa (vPARP, 193 kDa), además de algunos pequeños RNAs no traducidos (vRNA) se encuentran en el volumen interno de la vault como componentes minoritarios. Las vaults están presentes y conservadas en el reino eucariota, lo que sugiere una función biológica esencial, sin embargo, todavía no se conoce la función exacta de estas partículas. En un estudio previo, caracterizamos la dinámica estructural de vaults de rata, mediante la combinación de técnicas biofísicas con la expresión recombinante de vaults con mutaciones en la región central de interacción entre las dos mitades, y crio microscopía electrónica (cryo-EM), proponiendo un modelo mecanicista del ciclo de apertura y cierre de la partícula vault con implicaciones funcionales como encapsulación de carga, transporte y entrega. Dictyostelium discoideum es el único organismo descrito hasta ahora que presenta dos isoformas de la MVP similares en secuencia (MVPα y MVPβ). Previamente demostramos que las dos isoformas son esenciales para el ensamblaje de la vault. Resolver la estructura de las vaults de Dictyostelium arrojaría nueva luz sobre las relaciones evolutivas de estas singulares partículas entre eucariotas inferiores y superiores. En este trabajo hemos resuelto dos estructuras de vaults recombinantes de Dictyostelium, mediante técnicas de cryo-EM: una propia de las vaults (3.8 Å de resolución) y otra de vaults en complejo con un nanobody (5.1 Å de resolución) que reconoce un myc-tag insertado artificialmente en un bucle expuesto del dominio R6 de la MVPβ, con el objetivo de diferenciar ambas isoformas. En paralelo, con el objetivo de contribuir a la comprensión del papel de las vaults en el transporte intracelular, realizamos la caracterización preliminar de la estructura y las interacciones de estas partículas en su entorno nativo, in situ mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET).

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Tesis Doctorals - Facultat - Farmàcia i Ciències de l'Alimentació

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Deciphering the structure and dynamics of the vault particles